腦型鈉尿肽對神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞膜鉀離子通道的調(diào)控和機(jī)制研究.pdf

1、鈉尿肽家族是一個多肽類激素家族。該多肽以及其受體在生理和病理生理方面有著重要意義,涉及到腎臟系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等方面的調(diào)控,維持機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。眾多的研究表明,鈉尿肽可以調(diào)節(jié)許多離子通道。在神經(jīng)系統(tǒng)中,鈉尿肽作為一種神經(jīng)肽,激活細(xì)胞膜上的受體蛋白從而引發(fā)多種生物效應(yīng)。目前,有關(guān)腦型鈉尿肽對神經(jīng)系統(tǒng)離子通道的調(diào)控尚不清楚。我們選擇神經(jīng)系統(tǒng)兩種細(xì)胞模型:Schwann細(xì)胞(膠質(zhì)細(xì)胞)和小腦顆粒細(xì)胞(

2、神經(jīng)元),通過全細(xì)胞膜片鉗記錄,免疫組化和細(xì)胞增殖測試以及分子克隆技術(shù),研究腦型鈉尿肽(BNP)對這兩種細(xì)胞模型上的延遲整流鉀通道的調(diào)控機(jī)制,研究主要分以下三個部分:
　　 第一部分:我們以取自小鼠坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)周圍的Schwann細(xì)胞為膠質(zhì)細(xì)胞模型,研究BNP對細(xì)胞膜鉀電流以及細(xì)胞增殖的調(diào)制。通過全細(xì)胞膜片鉗記錄,我們發(fā)現(xiàn)BNP可增加Schwann細(xì)胞膜上TEA敏感的Ik(延遲外向整流鉀電流);在濃度為1 nM～500 n

3、M范圍內(nèi),這種增大作用具有部分濃度依賴性。同時,在100 nM BNP的作用下,Ik的半激活電位和半失活電位均發(fā)生左移。通過半定量PCR以及免疫組化鑒定,發(fā)現(xiàn)Schwann細(xì)胞表達(dá)A受體、B受體和C受體三種NP受體。先前的研究已表明BNP可與A受體和C受體結(jié)合,因此,我們使用NPR-A阻斷劑和激動劑進(jìn)行了涉及受體亞型的鑒定。實(shí)驗結(jié)果揭示,給予200 nM anantin(NPR-A阻斷劑)可抑制BNP的作用,而50 nM cANF(NP

4、R-C特異性激動劑)無法模擬BNP的作用,提示BNP對于Ik的作用是通過NPR-A這一途徑,而非NPR-C途徑。細(xì)胞外給予50μM8-Br-cGMP可模擬BNP對Ik的增大作用,而細(xì)胞外給予100μM db-cAMP則不能產(chǎn)生類似于BNP的效應(yīng)。這些結(jié)果進(jìn)一步提示BNP是通過A受體激動下游的cGMP通路,進(jìn)而激活I(lǐng)k。另外,我們將Schwann細(xì)胞在含有BNP的培養(yǎng)液中孵育五天,隨后通過增殖檢測和S100蛋白免疫組化標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)經(jīng)BNP處

5、理的Schwann細(xì)胞增殖能力有所增強(qiáng)。綜上所述,神經(jīng)肽BNP可增大Schwann細(xì)胞的Ik并對細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用。BNP對于細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,是否有鉀通道這一途徑的參與,還需進(jìn)一步研究證實(shí)。這些研究有助于我們了解神經(jīng)肽對于神經(jīng)系統(tǒng)各層面的調(diào)控,以及膠質(zhì)細(xì)胞自身的調(diào)控機(jī)制,并將這些研究應(yīng)用于神經(jīng)損傷治療。
　　 第二部分:我們在大鼠小腦顆粒細(xì)胞上研究BNP對細(xì)胞膜鉀電流的調(diào)制。通過免疫組化鑒定,我們發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞上表達(dá)三種

6、鈉尿肽受體。通過全細(xì)胞膜片鉗記錄,我們發(fā)現(xiàn)BNP可減小顆粒細(xì)胞上TEA敏感的Ik;在濃度為10nM～1000nM范圍內(nèi),這種增大作用具有部分濃度依賴性。同時,BNP可使小腦顆粒細(xì)胞Ik的半失活電位發(fā)生左移。給予200 nM anantin可抑制BNP的作用,而50 nM cANF無法模擬BNP的作用,提示BNP對于Ik的作用是通過NPR-A這一途徑,而非NPR-C途徑。細(xì)胞外給予50μM8-Br-cGMP可模擬BNP對Ik的增大作用。這

7、些結(jié)果進(jìn)一步提示BNP通過A受體激動下游的eGMP通路降低Ik。BNP對顆粒細(xì)胞上鉀電流的下調(diào),可能參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的興奮性,以及與細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制相關(guān)。
　　 第三部分:BNP對Schwann細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞上的延遲整流鉀通道的調(diào)控途徑相似,但是調(diào)控結(jié)果相反,可能是由于被調(diào)控的亞單位不同造成的。神經(jīng)細(xì)胞中IK的主要亞單位是Kv2.1α亞單位。我們使用Kv2.1α亞單位的特異性阻斷劑JZTX-Ⅲ。1μMJZTX-Ⅲ存在時,BNP

8、在顆粒細(xì)胞上對電流的抑制效果消失,電流幅度為原本的93.40±3.27％。而此時,BNP在Schwann細(xì)胞上對電流的增大效應(yīng)依舊存在,增大46.24±1.45％,和Kv2.1α亞單位未被抑制時的電流增大率46.73±7.26％相比,無顯著性差異。在顆粒細(xì)胞上BNP似乎僅對Kv2.1α亞單位有調(diào)控作用,而在Schwann細(xì)胞上Kv2.1α亞單位是BNP調(diào)控的一個對象之一。在轉(zhuǎn)染了pmCherry-Kv2.1的HEK293細(xì)胞上,BNP無