WNT4信號通路在PAX2基因誘導腎小管上皮細胞間充質轉分化中作用機制研究.pdf

1、腎間質纖維化(Renal Interstitial Fibrosis，RIF)是慢性腎功能衰竭進行性發(fā)展過程中的始動因素，是慢性腎臟疾病發(fā)展至終末腎病的共同途徑。腎間質纖維化的關鍵步驟是腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)即腎小管上皮細胞喪失上皮細胞表型的同時獲取成纖維細胞特征。越來越多的證據(jù)表明EMT在腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
　　 配對盒基

2、因2(Paired Box2，PAX2)編碼核轉錄因子，是腎臟胚胎發(fā)育過程中誘導腎小管上皮細胞轉分化的關鍵性發(fā)育基因之一，在前、中、后腎發(fā)育的全過程中表達，參與胚胎腎臟各個發(fā)育階段的調控，成熟腎單位其表達消失。近年來發(fā)現(xiàn)，PAX2基因在腎小球疾病腎小管上皮細胞有不同程度表達，認為PAX2回歸表達可能導致EMT，進而出現(xiàn)腎間質纖維化。由于體內作用因素復雜，存在諸多信號通路、信號分子及細胞因子，PAX2是否能直接誘導EMT至今尚無研究。

3、r>　　 以往對EMT機制的研究主要有TGFβ1、integrin/ILK、WNT/β-catenin等通路。近年來WNT/β-catenin通路在胚胎器官發(fā)育過程中研究較為深入，該項研究顯示:PAX2通過激活WNT4通路可促進S-形小管的形成及誘導后腎間充質細胞聚集并分化為上皮細胞，敲減PAX2將導致S-形小管的形成不良，間充質細胞聚集障礙而停止分化，故認為WNT4是PAX2的靶基因。在正常成熟大鼠腎臟中WNT4處于失活狀態(tài)，在腎間

4、質纖維化模型大鼠腎臟中WNT4明顯升高且活性增強，證實WNT4通過調控EMT，促進腎纖維化作用，將WNT阻斷后，腎臟纖維化程度減輕。但PAX2在腎間質纖維化模型大鼠腎臟重新表達后是否亦通過激活WNT4通路調控EMT至今尚無研究。
　　 本課題探討了WNT4信號通路在PAX2誘導腎小管上皮細胞EMT中的作用及其機制。通過構建高表達PAX2質粒穩(wěn)定轉染至腎小管上皮細胞，觀察PAX2是否可以直接誘導正常腎小管上皮細胞出現(xiàn)EMT;應用W

5、NT通路阻斷劑阻斷WNT通路，探討PAX2是否通過WNT通路調控腎小管上皮細胞EMT;應用WNT4siRNA沉默WNT4基因探討WNT4基因是否為PAX2誘導正常腎小管上皮細胞EMT的調控基因。
　　 材料和方法：
　　 一、WNT4信號通路在PAX2誘導正常腎小管上皮細胞間充質轉分化中的作用
　　 制備單側輸尿管結扎(unilateralurcteral obstructinn，UUO)大鼠模型，提取造模后第2

6、1天腎組織mRNA，擴增大鼠PAX2全長編碼序列，將該目的基因與真核表達載體pEGFP-C1質粒（含Neo抗性基因）進行定向連接，其產(chǎn)物轉化細菌感受態(tài)細胞，以PCR方法鑒定陽性克隆，并進行測序和分析比對，獲得融合蛋白表達質粒載體pEGFP-PAX2。通過陽離子脂質體介導將重組質粒pEGFP-PAX2轉染入體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定表達PAX2腎小管上皮細胞系。
　　 實驗細胞分為三組:對照組，空載組及

7、穩(wěn)轉組。
　　 應用熒光顯微鏡、Western blot和Realtime PCR法進行轉染鑒定。應用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。采用免疫熒光，Western blot和Realtime PCR檢測三組細胞表型標志物E鈣黏蛋白（E-cadherin）和α肌動蛋白(α-SMA)蛋白和mRNA的表達。應用細胞劃痕實驗觀察細胞遷移率。應用Transwell實驗觀察細胞侵襲程度。采用免疫熒光，免疫組化，Western blot及Realti

8、me PCR檢測WNT4及β-catenin蛋白和mRNA的表達。
　　 二、WIF-1阻斷WNT通路對PAX2誘導的腎小管上皮細胞間充質轉分化作用的影響
　　 實驗細胞分為四組:WIF-1（5ug/ml）;WIF-1(10ug/ml);WIF-1(15ug/ml);PAX2穩(wěn)轉對照組。
　　 應用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR和免疫熒光方法檢測β-catenin蛋白和mRNA的

9、表達。
　　 應用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR，免疫熒光方法檢測細胞表型標志物E-cadherin和α-SMA蛋白和mRNA的表達。應用細胞劃痕實驗觀察細胞遷移率。應用Transwell實驗觀察細胞侵襲程度。應用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　 三、WNT4基因沉默對PAX2誘導的腎小管上皮間充質轉分化作用的影響
　　 根據(jù)Geenbank設計大鼠WNT4靶向性siRNA:siR

10、NA1 siRNA2 siRNA3，用脂質體2000分別將WNT4 siRNA轉染至穩(wěn)定轉染PAX2腎小管上皮細胞系，應用Western blot和RT-PCR方法篩選最佳沉默位點。
　　 應用Western blot方法進行WNT4沉默鑒定。
　　 將最佳沉默位點WNT4 siRNA轉染至穩(wěn)定轉染PAX2腎小管上皮細胞系。實驗分為五組:穩(wěn)轉對照組，WNT4 siRNA24h組，WNT4 siRNA48h組，WNT4si

11、RNA72h組，WNT4 siRNA96h組。
　　 應用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR和免疫熒光方法檢測β—catenin蛋白和mRNA的表達。
　　 應用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR，免疫熒光方法檢測細胞表型標志物E-cadherin和α-SMA蛋白和mRNA的表達。應用細胞劃痕實驗觀察細胞遷移率。應用Transwell實驗觀察細胞侵襲程度。應用相

12、差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　 結果：
　　 一、WNT4信號通路在PAX2誘導正常腎小管上皮細胞間充質轉分化中的作用
　　 重組質粒pEGFP-PAX2鑒定:所得的PCR片段與預期大小1200 bp左右一致。將陽性克隆測序，測序結果經(jīng)blast分析，證實所插入的目的片段與genebank檢索的大鼠PAX2的cDNA序列100％匹配，說明PCR過程無突變發(fā)生。以上結果證明重組質粒pEGFP-PAX2構建成功。

13、>　　 轉染鑒定穩(wěn)定轉染組和空載組綠色熒光強度較對照組明顯增強。Western blot結果顯示:轉染組的PAX2蛋白表達明顯高于空載組及對照組(P＜0.05); RealtimePCR結果顯示:轉染組的PAX2基因表達明顯高于對照組(P＜0.05)，以上結果證明PAX2轉染成功。
　　 轉分化作用觀察相差顯微鏡下觀察:穩(wěn)定轉染組腎小管上皮細胞的形態(tài)較對照組及空載組伸長;細胞表型標志物表達檢測:免疫熒光結果顯示，穩(wěn)轉組細胞E-

14、cadherin染色較空載組及對照組明顯減弱;α-SMA染色較空載組及對照組明顯增強;Western blot檢測蛋白結果顯示:穩(wěn)轉組的E-cadherin明顯低于空載組及對照組(P＜0.05)，α-SMA明顯高于空載組及對照組(P＜0.05);Realtime PCR結果顯示:穩(wěn)轉組的E-cadherin基因明顯低于空白對照組(P＜0.05)，α-SMA基因明顯高于對照組(P＜0.05);細胞劃痕修復實驗結果顯示:PAX2穩(wěn)定轉染后1

15、0h及18h細胞遷移率較對照組及空載組明顯增加(P＜0.05);Transwell實驗結果顯示:PAX2穩(wěn)定轉染后細胞侵襲程度較對照組及空載組明顯增強(P＜0.05)。以上結果證明PAX2使正常腎小管上皮細胞出現(xiàn)EMT。
　　 PAX2轉染后對WNT4通路作用免疫組化結果顯示:穩(wěn)轉組細胞WNT4染色較空載組及空白對照組明顯增強;免疫熒光結果顯示:穩(wěn)轉組細胞β-catenin染色較空載組及空白對照組明顯增強;Western blo

16、t檢測蛋白結果顯示:穩(wěn)轉組的WNT4及β-catenin明顯高于空載組及空白對照組(P＜0.05);Realtime PCR結果顯示:穩(wěn)轉組的WNT4及β-catenin基因明顯高于空載組及空白對照組(P＜0.05)。以上結果證明PAX2可能激活了WNT4通路。
　　 二、WIF-1阻斷WNT通路對PAX2誘導的腎小管上皮細胞間充質轉分化作用的影響
　　 WIF-1對PAX2激活的WNT通路的阻斷作用Western bl

17、ot檢測蛋白結果顯示:WIF-1（5ug/ml）、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組β-catenin蛋白較PAX2穩(wěn)轉細胞組減少，WIF-1（15ug/ml）組最明顯(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR結果顯示:WIF-1（5ug/ml）、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組β-catenin mRNA較PAX2穩(wěn)轉細胞組減少，WIF-1（15ug/ml）組最明顯(

18、P＜0.05);免疫熒光結果顯示:WIF-1（10ug/ml）和WIF-1(15ug/ml)組β-catenin染色均較PAX2穩(wěn)轉細胞組減弱，其中WIF-1（15ug/ml）組最明顯。以上結果證明WIF-1阻斷了WNT通路。
　　 轉分化逆轉作用觀察Western blot檢測蛋白結果顯示:WIF-1(5ug/ml)、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組E-cadherin蛋白表達均較PAX2穩(wěn)轉細胞組

19、增多，其中WIF-1（15ug/ml）組最明顯(P＜0.05)。WIF-1（5ug/ml）、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1（15ug/ml）組α-SMA蛋白表達均較PAX2穩(wěn)轉細胞組減少，其中WIF-1（15ug/ml）組最明顯(P＜0.05);RT-PCR及Realtime PCR
　　 結果顯示:WIF-1(5ug/ml)、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1(15ug/ml)組E-cadherinmRNA表達

20、均較PAX2穩(wěn)轉細胞組增多，其中WIF-1(15ug/ml)組最明顯(P＜0.05)。WIF-1(5ug/ml)、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1(15ug/ml)組α-SMA mRNA表達均較PAX2穩(wěn)轉細胞組減少，其中WIF-1(15ug/ml)組最明顯(P＜0.05);免疫熒光結果顯示:WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組E-cadherin染色均較PAX2穩(wěn)轉細胞組增強，其中WIF-1（15ug/

21、ml）組最明顯;WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組α-SMA染色均較PAX2穩(wěn)轉細胞組減弱，其中WIF-1(15ug/ml)組最明顯;細胞劃痕實驗結果顯示:WIF-1（15ug/ml）組10h及18h細胞遷移率較PAX2穩(wěn)轉細胞組明顯減弱(P＜0.05);Transwell實驗結果顯示:WIF-1(15ug/ml)組細胞侵襲程度較PAX2穩(wěn)轉細胞組減弱(P＜0.05);相差顯微鏡下觀察:WIF-1(15ug/m

22、l)組細胞較穩(wěn)定轉染組細胞變圓，接近正常腎小管上皮細胞形態(tài)。以上結果證明阻斷WNT通路后使PAX2誘導的EMT的腎小管上皮細胞出現(xiàn)轉分化逆轉。
　　 三、WNT4基因沉默對PAX2誘導的腎小管上皮細胞間充質轉分化作用的影響
　　 WNT4基因沉默鑒定將WNT4 siRNA1，WNT4 siRNA2和WNT4 siRNA3分別轉染至穩(wěn)定轉染PAX2細胞。Western blot檢測蛋白結果顯示:WNT4 siRNA1，WN

23、T4siRNA2和WNT4 siRNA3三組WNT4蛋白表達較對照組均降低，以WNT4 siRNA3最明顯(P＜0.05);RT-PCR結果顯示:WNT4 siRNA1，WNT4 siRNA2和WNT4siRNA3三組WNT4 mRNA較對照組表達均降低，以WNT4 siRNA3最明顯(P＜0.05)。以上結果證明WNT4 siRNA3沉默效率較高，故下面實驗均選擇WNT4siRNA3行相關檢測。
　　 WNT4 siRNA3轉

24、染鑒定將WNT4 siRNA3轉染至穩(wěn)定轉染PAX2細胞，分別于24h、48h、72h及96h收集細胞。Western blot檢測蛋白結果顯示:沉默24h、48h、72h及96h后，WNT4蛋白表達較未沉默穩(wěn)轉對照組均降低，以72h最明顯（P＜0.05）。
　　 WNT4基因沉默對PAX2激活的WNT4通路的阻斷作用Western blot檢測蛋白結果顯示:沉默24h、48h、72h及96h后，β-catenin蛋白較未沉默穩(wěn)

25、轉對照組減少，72h組最明顯(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR結果顯示:WNT4沉默24h、48h、72h及96h后，β-catenin mRNA較未沉默穩(wěn)轉對照組減少，72h組最明顯(P＜0.05);免疫熒光結果顯示:沉默72 h組β-catenin染色較未沉默穩(wěn)轉對照組減弱。以上結果證明沉默WNT4基因阻斷了WNT4通路。
　　 轉分化逆轉作用觀察Western blot檢測蛋白結果顯示:沉默24h，4

26、8h，72h及96h后，各時間點細胞中的E-cadherin蛋白表達均較穩(wěn)轉對照組增多，72h組增多最明顯(P＜0.05)。各時間點細胞中的α-SMA蛋白表達均較穩(wěn)轉對照組減少，72h組減少最明顯(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR結果顯示:各時間點細胞中的E-cadherin mRNA表達均較穩(wěn)轉PAX2細胞組上調，72h組上調最明顯(P＜0.05)。各時間點細胞中的α-SMA mRNA表達均較穩(wěn)轉PAX2細胞組下

27、調，72h組下調最明顯(P＜0.05);免疫熒光結果顯示:沉默72 h組E-cadherin染色均較穩(wěn)轉對照組增強，α-SMA染色均較穩(wěn)轉對照組減弱;細胞劃痕實驗結果顯示:沉默72h組10h及18h細胞遷移率較PAX2穩(wěn)轉細胞組明顯減弱(P＜0.05);Transwell
　　 實驗結果顯示:沉默72h組細胞侵襲程度較PAX2穩(wěn)轉細胞組減弱(P＜0.05);相差顯微鏡下觀察沉默72h組細胞較穩(wěn)定轉染組細胞變圓，接近正常腎小管上皮