恒溫擴增型表面等離子體共振生物傳感器構建與結核桿菌及其多重耐藥突變位點檢測研究.pdf

1、背景：
　　近年來,由于人口數(shù)量及流動性增加、診治延誤和抗結核藥物的不規(guī)范使用,以及艾滋病等免疫缺陷病的流行,使得結核耐藥日趨嚴重,耐多藥結核(MDRTB)甚至廣泛耐藥結核(XDRTB)嚴重蔓延,嚴重危害社會公共衛(wèi)生安全。據(jù)WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,在全球22個結核及耐藥結核高負擔國家中中國位列第二,耐藥結核感染率全球第一。對于耐藥結核患者,早發(fā)現(xiàn)、早治療是取得成功治療的關鍵。在制定治療方案時,最好根據(jù)藥敏試驗結果進行個體化治療。對結核

2、分枝桿菌及其耐藥檢測的傳統(tǒng)方法,主要依靠痰涂片、培養(yǎng)、藥敏、PCR技術等多項試驗綜合分析,方法繁瑣、需時長、陽性率低、特異性差,提供的耐藥信息量少;而目前基于耐藥基因檢測的分子生物學技術,如直接測序法、PCR-SSCP、微陣列基因芯片法等,價格昂貴,操作要求高。因此,建立新型檢測結核菌耐藥基因型的方法,用于快速檢測耐藥結核菌,對結核病早期治療和控制耐藥菌的傳播具有重要意義。
　　表面等離子體共振(surfaceplasmonres

3、onance,SPR)傳感器是近年來迅速發(fā)展起來的新型光學傳感器,其原理在于當光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時,其對應的入射角即SPR角與金屬表面結合的分子質量成正比。它具有實時、無需標記、在線分析等優(yōu)勢,可通過換能器,將傳感器芯片表面配體與分析物作用的生物信號轉換為可檢測的光電物理信號,實現(xiàn)對樣本中靶分子的檢測。在傳感器相關檢測中以PCR為代表的核酸擴增技術常被用于提高檢測限。但由于復雜的熱循環(huán)過程帶來的非特異性擴增、與芯片表面

4、擴增的不兼容性以及增加的檢測成本,仍然是需要考慮的問題。RCA是一種恒溫的DNA擴增過程,可于短時間內在固相載體表面擴增出上千倍互補與環(huán)狀模板的串聯(lián)重復序列。與傳統(tǒng)PCR相比,RCA具有無需循環(huán)控溫、線性擴增、擴增產(chǎn)物易于固定等優(yōu)勢,近年來成為一種新穎的信號擴增工具用于DNA等痕量物質的超敏檢測。恒溫連接酶的特異性使該方法對單堿基突變有較高的敏感度和分辨率,具有鏈置換活性的多聚酶使該擴增反應能在恒溫條件下進行,且靶序列僅作為生成環(huán)狀模板

5、的支架,避免了可能的擴增污染和潛在的生物危害。
　　本研究結合課題組前期的研究基礎,將芯片表面錨定RCA與SPR生物傳感技術相整合,建立了一種新型的恒溫擴增型SPR生物傳感器陣列,利用自行設計的標簽型鎖式探針(PadlockProbe,PLP),可實現(xiàn)多重點突變的恒溫、高通量、無標記檢測。并將其運用于結核桿菌耐藥相關基因突變位點的多重檢測,可直接對結核桿菌核酸及其多重耐藥基因的5種常見突變位點進行恒溫快速檢測,為結核分枝桿菌及耐藥

6、基因快速鑒定和流行病學調查等提供堅實的實驗基礎。
　　方法：
　　1.利用磁珠顆粒模擬固相反應體系,根據(jù)生物配體的共價偶聯(lián)將氨基修飾的寡核苷酸探針(捕獲探針)固定于羧基修飾的磁珠表面構成固相反應生物敏感膜,探討固相RCA反應的具體方式和最優(yōu)反應體系。利用SRBR-GreenII對液相RCA擴增體系進行熒光定量觀察,以確定液相擴增反應的最佳體系。
　　2.在前期研究基礎上,對SPR生物傳感器檢測平臺的硬件設施和軟件設施進

7、行改進,增加檢測通道,改進溫控和流速控制系統(tǒng)及分析物流通方式。對傳感器芯片自組裝相關方法進行改進并制備生物敏感膜。
　　3.NCBI數(shù)據(jù)庫查找針對四種臨床常用一線抗結核藥物的5種耐藥基因主要突變位點。利于PrimerPremier5.0設計包含標簽序列、通用序列、兩端識別序列的鎖式探針(PLP),并對形成的環(huán)狀探針進行二級結構預測和分析。利于ArrayDesigner4.0軟件,設計包含標簽序列探針,使各探針間保持較好的一致性和特

8、異性。探討雜交時間、雜交溫度、擴增時間等各項反應條件對SPR信號值的影響,確定芯片表面RCA反應的最佳條件。
　　4.將納米金信號放大與固相表面錨定RCA反應相結合,通過納米金顆粒修飾的通用序列探針與固相表面RCA反應產(chǎn)物的大量串聯(lián)重復序列雜交,從而產(chǎn)生具有強大信號放大能力的聯(lián)級信號放大效果。優(yōu)化納米金信號放大系統(tǒng)的反應條件,并以人工合成的模式DNA分子檢測該反應系統(tǒng)的靈敏度和特異性。
　　5.根據(jù)GenBank找到的結核分

9、枝桿菌16s-23srRNA基因ITS序列,設計包含硫代磷酸化修飾的酶切位點的鎖式探針,建立基于靶引物的液相RCA反應鑒定結核與非結核分枝桿菌SPR生物傳感器檢測方法,并實現(xiàn)液相RCA反應的無標記實時動態(tài)監(jiān)測。
　　6.以34例臨床標本為檢測對象,針對四種一線抗結核藥物的五個突變位點進行MDRTB臨床標本的SPR生物傳感器檢測,并與測序結果對照;對建立的恒溫型SPR生物傳感器微陣列檢測方法進行方法學比較和評估,并確定臨床樣本檢測步

10、驟。
　　結果：
　　1.完成以磁珠為載體的固相RCA體系構建,并確定以液相連接后固相載體表面擴增的方式進行反應。固相RCA的最佳反應體系為0.5U/μLPhi29DNApolymerase,0.2μg/μLBSA,5％DMSO,1mMdNTPs。連接產(chǎn)物及RCA產(chǎn)物電泳結果顯示,僅在突變型靶序列存在條件下生成的環(huán)狀模板可引發(fā)固相表面RCA反應,反之則無產(chǎn)物生成。
　　2.成功構建新型恒溫固相擴增型SPR生物傳感器檢測

11、儀,傳感器芯片為20mmx28.6mm鍍金膜棱鏡,檢測流池為8通道串聯(lián)流通池。系統(tǒng)溫度控制范圍為25℃-60℃,溫控精度±0.1℃;流速范圍為5-2000μL/min,流速控制精度為±1μL/min;檢測池在反應中能保持穩(wěn)定負壓,以保證系統(tǒng)反應的穩(wěn)定性;采用巰基末端修飾共價結合法將還原型捕獲探針自組裝于芯片金膜表面,探針濃度為1μM。
　　3.利用自行設計的鎖式探針可以完全分辨靶序列單堿基突變,RCA可將SPR信號值(突變位點信號

12、)放大10.0倍,突變識別率為5000:1(野生型與突變型靶序列的濃度比)。連接產(chǎn)物、RCA產(chǎn)物、以及RCA產(chǎn)物HhaI酶切電泳條帶位置準確,明亮清晰。自行設計的捕獲探針特異性好、各探針之間具有相同的長度和相近的Tm值(<1℃),可使各探針在相同條件下雜交,適于傳感器微陣列系統(tǒng)的多通道并行檢測。檢測最適液相靶序列雜交溫度為45℃,芯片表面雜交溫度為37℃,RCA擴增時間為30min。
　　4.針對5種臨床常見結核桿菌耐藥主要突變位

13、點:異煙肼(INH):KatG315(AGC→ACC),inhA-15(ACG→ATG);利福平(PFP):rpoB526(CAC→TAC);乙胺丁醇(EMB):embB306(ATG→GTG);鏈霉素(SM):rpsL43(AAG→AGG),設計包含標簽型鎖式探針及相應捕獲探針的探針組,并實現(xiàn)了芯片表面各突變位點的多重擴增檢測,同一突變位點對突變型和野生型靶序列的SPR信號值差異明顯(p<0.01),各突變位點間交叉反應結果顯示SPR

14、信號值差異明顯(p<0.01)。
　　5.建立的納米金信號放大系統(tǒng)可有效提高檢測的靈敏度,直徑15nm的納米金顆粒在pH7.5和8%工作濃度下可將SPR信號值(RCA放大后)放大2.1倍,與陰性和空白對照信號值比較有顯著性差異(p<0.01)。對合成靶序列的檢測檢測限為5X10-12M(59.1±7.1mo),且在10-12M至10-8M濃度范圍內成線性相關(y=615.29x+1323.8,R2=0.9846)。
　　6.

15、建立的液相target-primedRCASPR生物傳感器檢測系統(tǒng),可通過兩步法在4h內完成對結核分枝桿菌群復合群(MTBC)和鳥型分支桿菌群復合群(MAC)的恒溫(37℃)快速檢測。SPR方法對臨床標本的檢測結果與菌種鑒定結果一致。最低檢測限分別為MTBC:4.2X104CFU/mL(0.005ng/μL),MAC:3.7x104CFU/mL(0.002ng/μL);經(jīng)特殊設計的鎖式探針可使液相RCA反應與限制性內切酶反應同時進行,實

16、現(xiàn)無標記的SPR實時動態(tài)監(jiān)測RCA反應。
　　7.采用試劑盒法和加熱堿裂解法對24例臨床分離株標本和10例臨床分泌物樣本提取基因組DNA結果顯示,堿裂解法操作簡便,對臨床分泌物標本和臨床分離株均有較好的提取效果,可作為樣本的前處理方法。SPR傳感器方法檢測34例臨床標本,檢測限為8.2pg/μL(65.7±8.5mo)臨床標本基因組DNA,臨床靈敏度和特異性與測序方法比較分別katG315:92%和80%;inhA-15:100%

17、和100%;rpoB526:94.4%和100%;embB306:95%和100%;rpsL43:100%和100%。經(jīng)Kappa檢驗兩種方法檢測結果具有較好的一致性性差異(p<0.05,Kappa>0.75)。
　　結論：
　　1.新型恒溫擴增型SPR生物傳感器,改變了普通高靈敏性傳感器檢測對PCR方法的依賴。其穩(wěn)定密閉的檢測系統(tǒng)和簡單低耗能的操作,有利于傳感器的小型化和便攜性。
　　2.自行設計的標簽型鎖式探針,不

18、僅可在高背景干擾下識別突變靶序列,還可實現(xiàn)混合靶序列的多重連接反應。其包含的標簽序列,可實現(xiàn)芯片表面的多重固相擴增反應,且反應條件一致,交叉反應小,增加了傳感器微陣列的檢測通量。
　　3.納米金信號放大系統(tǒng)可顯著增加SPR芯片表面的等離子共振強度,有效提高傳感器的檢測靈敏度,為SPR生物傳感器的痕量物質檢測提供了一種可靠的信號放大方法,在核酸非擴增快速檢測及生物傳感器領域有較大的應用潛力。
　　4.基于靶引物的液相RCA型S

19、PR生物傳感器檢測系統(tǒng),在保證特異性與敏感性的基礎上,可快速恒溫地實現(xiàn)對液相擴增反應的無標記實時動態(tài)監(jiān)測,為核酸擴增檢測提供了一條新思路。
　　5.構建的新型SPR生物傳感器檢測系統(tǒng),可在4小時內同時檢測五種臨床常見MDRTB耐藥突變位點,檢測方法具有靈敏、特異、操作簡單、快速的特點。與傳統(tǒng)基因芯片相比,極大降低了技術、設備要求和檢測成本。為臨床結核桿菌耐藥的恒溫快速檢測乃至其他基因檢測提供一種新方法新思路,有望彌補現(xiàn)有常規(guī)檢測方