大鼠肺缺血再灌注損傷基因表達譜的變化和骨髓間充質(zhì)干細胞的干預作用.pdf

1、第一部分大鼠肺缺血再灌注損傷不同時期基因表達譜的變化
　　 目的：探討缺血再灌注誘導大鼠肺組織損傷不同時期基因表達譜的變化，闡明肺缺血再灌注的動態(tài)損傷機制，通過篩選損傷和修復的相關基因，為肺缺血再灌注損傷的干預治療提供新的線索和思路。
　　 方法：雄性SD大鼠36只，實驗隨機分為對照組(假手術(shù)組,6只)和缺血再灌注組(I/R 0、1、3、6、24小時組，各組6只)。通過阻斷肺門建立大鼠肺缺血再灌注損傷模型，于再灌注后不同

2、時間點取大鼠肺組織并提取標本總RNA, 運用包含22 226個大鼠基因點的Illumina RatRef-12 全基因組表達譜微珠芯片檢測對照組和模型組肺缺血再灌處理后不同時間點的基因表達情況，并采用SOM算法將具有相似表達模式的基因進行聚類分析。
　　 結(jié)果：缺血后再灌0，l，3，6，24 h分別有648，340，711，1279，641個基因表達發(fā)生改變。根據(jù)基因的功能不同將部分發(fā)生顯著改變的基因分為七類，包括炎性相關因子、

3、凋亡調(diào)控相關蛋白、氧化與抗氧化分子、代謝相關酶類、離子通道及水通道、信號傳導分子以及補體系統(tǒng)等七類。同時通過聚類分析將具有相同表達模式的基因被聚為l2類。
　　 結(jié)論：缺血再灌注可以誘導肺的基因表達譜發(fā)生改變，基因表達譜芯片能夠快速、高效地篩選差異表達基因，多種不同功能的基因相互影響共同造成肺缺血后再灌損傷，具有相似表達模式的基因可能具有相似的功能或相似的表達調(diào)控機制。
　　 第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性和誘

4、導分化
　　 目的：建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MesenchymAlStem Cells, MSCs)的分離和培養(yǎng)方法，探討MSCs的生物學特性和不同情況下的多向分化潛能，為將MSCs作為基因載體應用于體內(nèi)細胞治療和構(gòu)建新型氣管組織工程軟骨種子細胞提供理論基礎。
　　 方法：采用原代貼壁法獲得間充質(zhì)干細胞，觀察細胞形態(tài)和生長變化，篩選細胞培養(yǎng)的最佳條件。流式細胞儀鑒定細胞表面標志，體外誘導間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞、成骨細胞

5、和軟骨細胞分化。采用EGFP慢病毒載體感染培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞，比較細胞感染前后生物學特性。觀察綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）基因通過慢病毒載體感染MSCs的表達情況。
　　 結(jié)果：原代貼壁法獲可獲得純度較高的MSCs，穩(wěn)定培養(yǎng)液的pH值能使MSCs穩(wěn)定傳代。流式細胞儀檢測示大鼠MSCs的表型為CD11b-CD34-CD44+CD45-CD90+CD-106+。體外MSCs能誘導分化為

6、脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞。慢病毒載體可有效感染大鼠MSCs，EGFP在MSCs中能長期穩(wěn)定表達，聚凝胺可增強感染效率。
　　 結(jié)論：穩(wěn)定pH值的培養(yǎng)液能使大鼠間充質(zhì)干細胞保持旺盛的生長能力，間充質(zhì)干細胞具有良好的多向分化能力。慢病毒能高效感染間充質(zhì)干細胞， GFP基因能在間充質(zhì)干細胞中長期穩(wěn)定表達。本研究建立了一種有效、穩(wěn)定、持久的大鼠骨髓MSCs分離培養(yǎng)及熒光基因標記技術(shù)，為研究MSCs的轉(zhuǎn)歸、可塑性及基因治療奠定了基礎。

7、
　　 第三部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對肺缺血再灌注損傷的干預作用
　　 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）植入大鼠肺缺血再灌注損傷（I/R）模型中的效應、分化及其相關的作用機制。
　　 方法：分離純化培養(yǎng)MSCs，進行GFP標記，將MSCs注射大鼠肺I/R損傷模型及對照組，觀察再灌注后6h、1d、3d、7d等時間點肺的病理變化及功能改變，以及不同時間點MSCs向肺內(nèi)遷移和在肺內(nèi)的存留情況，通過免疫組化方法觀察

8、在肺內(nèi)MSCs的分化。實時熒光定量PCR檢測肺組織TNF-αmRNA和C5 mRNA表達變化，ELISA檢測IL-1β、IL-10、IL-17、KGF、MIP-1α等炎性因子含量的改變。
　　 結(jié)果：MSCs植入I/R模型可以降低肺濕重比和MPO活力，MSCs可以向肺內(nèi)遷移，以24h 至3d 數(shù)量較多，再灌后7d仍可見存留于肺內(nèi)，數(shù)量減少，但7d時觀察到帶有EGFP和SP-C雙標陽性的MSCs。相對于單純I/R損傷組，MSCs可