鏈霉菌噬菌體φC31整合酶的性質(zhì)和功能及其在哺乳動物細胞的應用研究.pdf

1、利用基因轉移技術有效地將目的基因位點特異性地整合到哺乳動物細胞的基因組中,從而避免外源基因隨機插入基因組,這是基因治療和轉基因動物研究中未解決的重要問題。鏈霉菌噬菌體ΦC31整合酶可以將外源核苷酸序列定點整合到哺乳動物細胞基因組的特異性位點上,從而極大的降低了由于外源基因隨機插入造成的基因突變風險,可以成為在哺乳動物細胞中進行轉基因位點特異性重組操作和基因治療的有用工具?，F(xiàn)在常用的幾種基因轉移途徑,病毒載體由于隨機整合和免疫學性質(zhì),安全

2、性一直受到人們的質(zhì)疑。非病毒載體如裸DNh載體的轉移效率受不同細胞類型的影響,也有潛在的隨機整合外源基因到宿主基因組的可能性。近年來新出現(xiàn)的蛋白轉導技術能夠在幾乎不受細胞類型限制的條件下,轉移一個活性的蛋白進入哺乳動物細胞中,在體內(nèi)可以通過小鼠的血腦屏障,提示該技術可以作為一種新的基因轉移途徑在基因治療和轉基因動物研究中得到應用。
　　 本文首先研究了ΦC31整合酶在體外的生物學特性。我們通過建立新的體外ΦC31酶的活性檢測系統(tǒng)

3、,表達純化了23.8U/mg的重組中ΦC31整合酶蛋白,它能夠在pH6.5-11,溫度9-37℃的條件下表現(xiàn)酶活性。在最適條件下(pH8.5,溫度20℃),ΦC31整合酶蛋白的Km和Vmax分別是6.261nmol/L和0.8621nM-1min-1。利用原子吸收質(zhì)譜分析(ICP-mass)發(fā)現(xiàn),ΦC31整合酶蛋白結合高濃度的K+離子,沒有發(fā)現(xiàn)結合Ca2+,Mg2+和Mn2+等金屬離子的特性。紅外傅立葉光譜(FT-IR)和圓二色儀(CD

4、)對該蛋白構象的研究表明,蛋白二級結構中的α-螺旋,β-折疊和無規(guī)則的卷曲的比例十分敏感地受pH值,溫度,離子濃度和酶的DNA底物等條件的影響。在一些蛋白酶的抑止劑(如EDTA,EGTA,2-ME,PMSF,DTT)和低濃度的去垢劑(如0.1％Tween20和TritonX-100)的條件下,該整合酶活性基本不受影響。以上研究表明ΦC31整合酶的性質(zhì)與已發(fā)現(xiàn)的入重組酶家族成員(如Cre重組酶)完全不同,是一種新型的絲氨酸重組酶。ΦC31

5、整合酶體外檢測系統(tǒng)的建立和酶動力學性質(zhì)的研究,將為后續(xù)的以該酶為代表的大分子量的絲氨酸整合酶家族的結構和功能研究奠定基礎。
　　 在哺乳動物細胞中應用ΦC31整合酶在基因轉移途徑上仍然需要考慮其有效性和安全性。蛋白轉導技術可以轉移一個不受細胞類型限制的外源蛋白進入哺乳動物細胞中,轉導后的蛋白在細胞中瞬時存在并表現(xiàn)生物活性。這一技術為有效地應用ΦC31整合酶介導的定點整合提示了新的方向。為了建立ΦC31整合酶的蛋白轉導系統(tǒng),我們構

6、建了定量檢測ΦC31整合酶功能的哺乳動物的293-PB[EGFP]報告細胞系。流式細胞儀分析(FACS)和細胞免疫組織化學的實驗證實,我們制備的融合TAT-PTD(HIV-1的Tat蛋白的47-57aa的蛋白轉導結構域)的ΦC31整合酶蛋白能夠以密度依賴性的方式進入所有與之共孵育的哺乳動物細胞中,并且有效地介導特異性核苷酸序列位點的精確重組反應。至此,一個新的能夠在哺乳動物細胞中應用蛋白轉導技術,轉移ΦC31整合酶的方法體系得到了初步的

7、建立。
　　 我們從哺乳動物細胞中ΦC31整合酶的細胞定位與功能的研究入手,發(fā)現(xiàn)增加外源的ΦC31整合酶在細胞核內(nèi)的分布,能夠很好地增加該酶介導的細胞染色體水平的重組功能。為了更好在哺乳動物細胞中應用ΦC31整合酶,我們用NLS(SV40大T抗原的核定位信號)對ΦC31整合酶蛋白的C端進行了修飾。通過ΦC31整合酶分別以蛋白轉導和質(zhì)粒DNA轉染的細胞學實驗,證實C端融合NLS的ΦC31整合酶能夠在哺乳動物細胞中有更好的重組效果。

8、根據(jù)上述結果,我們利用TAT和NLS修飾的ΦC31整合酶(TAT-ΦC31-NLS)經(jīng)蛋白轉導介導人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因特異性地整合到哺乳動物細胞基因組中,篩選得到的細胞系能夠長期高效表達hFIX蛋白,并且表現(xiàn)出大約50％的外源hFIX基因位點特異性地整合在細胞基因組的psiA位點。在細胞中的瞬時存在的TAT-ΦC31-NLS能夠介導外源基因定點整合到細胞基因組。活性TAT-ΦC31-NLS蛋白轉導4天后的細胞,蛋白免疫印記(Wes

9、ternblot)實驗已經(jīng)不能檢測到細胞中殘存的整合酶蛋白。細胞周期和早期細胞凋亡分析實驗表明,TAT-ΦC31-NLS蛋白轉導對293和COS-1等哺乳動物細胞沒有明顯的影響。至此,我們應用TAT-ΦC31-NLS蛋白優(yōu)化了ΦC31整合酶的蛋白轉導技術,并且在哺乳動物細胞中有效介導外源hFIX基因定點整合在細胞基因組中,從而為更安全有效的轉移ΦC31整合酶進入細胞的途徑提供了新的例證。TAT-ΦC31-NLS整合酶蛋白能夠從大量培養(yǎng)的

10、細菌中經(jīng)過一步快速的親和純化步驟制備,我們希望它能作為一個有效的工具應用在哺乳動物細胞的基因操作和基因治療的領域。
　　 綜上所述,本文說明了鏈霉菌噬菌體ΦC31整合酶的在體外催化重組反應的特性,為ΦC31整合酶在體外的基因重組操作和細胞中介導定點整合的應用提供了基礎;通過對ΦC31整合酶的修飾和轉移方法的優(yōu)化,建立了在細胞中更有效和安全地利用ΦC31整合酶的蛋白轉導方法,從而避免了利用的病毒和DNA載體可能造成的ΦC31整合酶