家蠅MdMtn1和MdSERP1基因的克隆、表達與蛋白功能檢測.pdf

1、家蠅是一種重要的資源昆蟲，其幼蟲和成蟲通常生活在腐敗物質多、雜菌橫生的環(huán)境中，對不良環(huán)境有很強的適應能力。金屬硫蛋白和內質網(wǎng)應激相關蛋白都是重要的抗逆蛋白。了解家蠅抗逆蛋白的功能對了解其在不良環(huán)境下的生物抗逆機制有著重要意義。
　　 本文以家蠅幼蟲為研究對象，研究內容主要分為以下5個部分：
　　 第1部分：通過RACE 技術從家蠅幼蟲體內克隆到1條家蠅金屬硫蛋白基因MdMtn1（GenBank 登錄號為GU289398）

2、，并對其核苷酸和編碼的蛋白序列進行了生物信息學分析；
　　 第2 部分：以家蠅β-actin基因為內參，利用實時熒光定量PCR 技術分析了MdMtn1基因在鎘刺激不同時間和不同濃度時mRNA表達量的變化；
　　 第3 部分：構建了家蠅MdMtn1基因的原核表達載體，在大腸桿菌DE3 宿主菌體內實現(xiàn)了誘導表達，并檢測了重組菌拮抗重金屬鎘的能力；
　　 第4 部分：對家蠅內質網(wǎng)應激相關蛋白MdSERP1（contig

3、 481）基因及其編碼的蛋白質序列進行了生物信息學分析，并且利用實時熒光定量PCR 技術分析了家蠅幼蟲MdSERP1基因在菌刺激和鎘刺激下mRNA表達量的變化；
　　 第5 部分：對家蠅MdSERP1基因進行了原核表達，并對表達的蛋白進行了純化，以純化后的DsbA-SERP1融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了抗血清。
　　 研究結果如下：
　　 （1）家蠅MdMtn1基因序列全長408 bp，包含1個123 bp的

4、開放閱讀框，可編碼40個氨基酸殘基，其中半胱氨酸殘基10個，呈-C-X-C-方式排列。該金屬硫蛋白的理論分子量為3.8 kD，等電點為8.78。同源比對分析發(fā)現(xiàn)，家蠅金屬硫蛋白與黑腹果蠅Drosophila melanogaster和擬果蠅D. Simulans的金屬硫蛋白MtnA 氨基酸序列具有較高相似性（identity=69％）。
　　 （2）能使家蠅幼蟲半致死的CdCl2濃度為30mmol/L，實時熒光定量PCR結果表明

5、，當用30mmol/L的鎘誘導家蠅幼蟲時，MdMtn1基因的表達量呈現(xiàn)先降后升的趨勢，在誘導24 h后基因表達量高于未刺激時MdMtn1基因的表達量；而用不同濃度Cd2+刺激家4）家蠅MdSERP1基因含1個195 bp的開放閱讀框，可編碼64個氨基酸；蛋白相對：經(jīng)金黃色葡萄球菌刺激后，MdSERP1基因M主菌中的蠅幼蟲24 h后取樣，進行定量發(fā)現(xiàn)，不同濃度Cd2+對MdMtn1基因的誘導程度不同，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當CdCl2濃度為

6、10mmol/L，MdMtn1基因表達量最高。
　　 （3）利用原核表達載體pET-DsbA，成功實現(xiàn)了MdMtn1基因在大腸桿菌中的融合表達，獲得的融合蛋白DsbA-MdMtn1分子量為28.5 kD；為了進一步了解MdMtn1是否具有重金屬鎘結合能力，將能表達金屬硫蛋白的DE3菌株涂布于含CdCl2的培養(yǎng)基上，結果證實表達MT的大腸桿菌耐受重金屬鎘的能力得到了顯著增強：當CdCl2的工作濃度等于20mmol/L時，MT重組菌

7、的生長狀況良好，而作為陰性對照的空載菌則不能生長。
　　 分子量為7.15 kD，理論等電點為10.38，存在1個疏水區(qū)和跨膜區(qū)，大約在該蛋白的第36-58 位；不含信號肽。利用Conserved Domain Search 工具進行的蛋白結構功能域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于RAMP4蛋白超家族；同源比對結果發(fā)現(xiàn)，不同物種的SERP1序列的N-末端差異較大，而跨膜區(qū)所在的C-末端較為保守，并且除少數(shù)種類外，SERP1氨基酸序列的長度基本

8、上保持在64-66個氨基酸。
　　 （5）對家蠅幼蟲進行了菌刺激和鎘刺激實驗的相對表達量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，刺激24 h后表達量達到最大值，之后其表達量開始逐漸下降；在大腸桿菌刺激后的家蠅幼蟲中，MdSERP1基因呈現(xiàn)先降低后又逐漸恢復的趨勢，在刺激后6 h時達到最低點，在刺激36 h后， dSERP1基因的表達量較未刺激時有所升高，且差異顯著；鎘刺激對MdSERP1基因的誘導趨勢與MdMtn1基因類似，最高表達量的濃度和時間以