骨髓間充質干細胞在淋巴細胞參與下影響HBV復制的體外研究.pdf

1、目的：探討骨髓間充質干細胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BM MSCs）在體外淋巴細胞參與下對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）復制的影響及其機制的初步研究。
　　方法：⑴選用體重80-100gBN大鼠，應用全骨髓培養(yǎng)/貼壁分離篩選法，分離、培養(yǎng)并擴增BM MSCs，應用流式細胞術對所培養(yǎng)的第3代細胞進行表面標記分子鑒定，并通過誘導培養(yǎng)分化為脂肪、成骨細胞，檢測BM

2、MSCs的分化能力。⑵細胞共培養(yǎng)：選取狀態(tài)良好的第三代BM MSCs，提取BN大鼠新鮮的脾淋巴細胞，選擇培養(yǎng)狀態(tài)良好的HepG2.2.15細胞，采用Transwell小室做細胞共培養(yǎng)。實驗分組：共5組，第1組為單純脾淋巴細胞組；第2組為單純HepG2.2.15細胞組；第3組為BM MSCs+Hep G2.2.15細胞組；第4組為脾淋巴細胞+HepG2.2.15細胞組；第5組為脾淋巴細胞+BM MSCs+HepG2.2.15細胞組。⑶在共

3、培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，采用MTT法對脾淋巴細胞及貼壁細胞進行細胞活性檢測，實時定量PCR測定上清液中HBV DNA水平、HepG2.2.15細胞內HBV cccDNA水平及BM MSCs中的HBVcccDNA水平，流式細胞術對T淋巴細胞亞群的比例變化進行檢測，應用ELISA法檢測上清液中細胞因子IFN-γ、IL-10水平。
　　結果：①BM MSCs鑒定：在體外成功提取并擴增BM MSCs，對所提取的細胞進行鑒定，其

4、具備典型的 MSCs的形態(tài)特點，培養(yǎng)到第3代細胞進行表面標記分子學鑒定，結果顯示：CD29、CD90、RT1A表達的陽性率分別為97.0％、96.3%和96.3%，而CD34、CD45、RT1B陰性率均>95％，且經(jīng)誘導培養(yǎng)分化后，所提細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)能夠成功分化為成骨細胞（經(jīng)由von kossa染色后在顯微鏡下可以觀察到黑色鈣鹽沉積）及脂肪細胞（經(jīng)由油紅 O染色后顯微鏡下可觀察到細胞胞漿內呈紅色脂滴）。②檢測BM MSCs對HBV復制的

5、影響：在體外細胞培養(yǎng)的環(huán)境下HBV DNA及HBV cccDNA在24h、48h及72h時，與第2、3和4組比較，第5組HBV DNA的表達水平明顯降低，且在48h時差異顯著， HBV DNA：（181.000±14.731）IU/mLvs（6270.000±300.450）IU/mL、（2564.000±231.058）IU/mL、（2433.300±302.379）IU/mL；HBV cccDNA：（4.330×105±0.464×

6、105）IU/mL vs（11.100×105±0.375×105）IU/mL、（8.930×105±0.778×105） IU/mL、（9.850×105±0.810×105）IU/mL，P<0.01；各組BM MSCs中均未檢測出HBV cccDNA的復制。③BM MSCs對HBV復制影響機制：細胞因子檢測結果，上清中淋巴細胞及BM MSCs分泌IFN-γ的水平與HBV DNA水平呈負相關（淋巴細胞24 h：r=-0.900；48

7、h：r=-0.982；72 h：r=-0.968，P<0.05。BM MSCs24h：r=-0.828；48h：r=-0.922；72h，r=-0.828，P<0.05），而IL-10水平與HBV DNA水平呈正相關（24h：r=0.860，48h：r=0.972，P<0.05）。T細胞亞群檢測，結果顯示CD4+/CD8+比例有所升高，且經(jīng)相關性分析，共培養(yǎng)后淋巴細胞表面標志CD8+細胞的百分率與HBV DNA水平呈正相關（24h：r=