NF-κB-AP-1與mTOR信號(hào)通路在抗β2GPI抗體誘導(dǎo)血栓相關(guān)分子表達(dá)中的作用.pdf

1、目的:抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)是一種非器官特異性自身免疫性疾病，血栓形成是其主要的病理基礎(chǔ)和最突出的臨床表現(xiàn)，也是APS首要的死因。研究表明，血清中高滴度的抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，aPL)（尤其是抗β2GPI抗體）在APS血栓形成起著極其關(guān)鍵的作用，但是具體的機(jī)制仍不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抗β2GPI抗體/β2GPI復(fù)合物能夠通過(guò)刺激核因子κ

2、B(nuclear factor kappa B，NF-κB)和激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)的活化，從而誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)組織因子(tissuefactor，TF)和炎癥因子，但目前還缺乏足夠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)闡述NF-κB和AP-1在aPL/抗β2GPI抗體誘發(fā)體內(nèi)血栓形成中的作用。此外，近期有研究表明，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物（the mammaliantarget of rapamycin comple

3、x，mTORC）通路在APS血管壁內(nèi)皮炎癥激活導(dǎo)致血管損傷的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。因此，本論文旨在前期研究的基礎(chǔ)上，分別利用實(shí)驗(yàn)性APS(EAPS)小鼠模型和單核細(xì)胞（THP-1和人外周血單核細(xì)胞）探討NF-κB/AP-1和mTOR在抗β2GPI自身抗體誘導(dǎo)血栓形成中的作用及其調(diào)控的效應(yīng)分子，為APS血栓形成的防治提供新思路。
　　方法:
　　(1)建立EAPS小鼠模型，BALB/c小鼠分別于0h和48 h腹腔注射抗β2GPI

4、抗體（500μg/只）或APS病人來(lái)源的IgG(IgG-APS)（500μg/只），72h后用于實(shí)驗(yàn)。取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，超聲裂解，收集細(xì)胞總蛋白，Western blotting方法檢測(cè)NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情況，驗(yàn)證anti-β2GPI自身抗體是否能誘導(dǎo)NF-κB和AP-1的活化。
　　(2)BALB/c小鼠先用NF-κB抑制劑PDTC(100mg/kg/day)或/和AP-1抑制劑姜黃素(curcu

5、min，Cur)(50mg/kg/day)預(yù)處理2h，再進(jìn)行腹腔注射抗β2GPI抗體（500μg/只），取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和胸主動(dòng)脈，Western blotting方法檢測(cè)NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情況，觀察PDTC和姜黃素對(duì)抗β2GPI抗體誘導(dǎo)NF-κB和AP-1活化的影響。
　　(3)取EAPS小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、雙側(cè)頸動(dòng)脈和胸主動(dòng)脈，運(yùn)用RT-qPCR和Western blotting方法分別檢測(cè)TF、

6、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白的表達(dá)，Xa生成法檢測(cè)TF活性，免疫熒光檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)TF、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)，從而進(jìn)一步分析NF-κB和AP-1活化對(duì)抗β2GPI抗體誘導(dǎo)小鼠TF和促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響。
　　(4)采用抗β2GPI抗體（10μg/mL）/β2GPI(100μg/mL)或APS-IgG（250μg/mL）/β2GPI（1

7、00μg/mL）復(fù)合物處理THP-1細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞一段時(shí)間后，收集細(xì)胞總蛋白、RNA及上清液，運(yùn)用RT-qPCR方法檢測(cè)TF和IL-8的mRNA的表達(dá)，Xa生成法檢測(cè)TF活性，ELISA方法檢測(cè)IL-8的表達(dá)，Westernblotting方法檢測(cè)mTOR磷酸化的情況，觀察抗β2GPI抗體/β2GPI或APS-IgG/β2GPI誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)TF和IL-8及mTOR活化的情況。
　　(5)先采用mTOR抑制劑雷帕霉素（r

8、apamycin，100nM）預(yù)處理THP-1細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞20h后，再用抗β2GPI抗體/β2GPI或APS-IgG/β2GPI復(fù)合物處理一段時(shí)間后，收集細(xì)胞總蛋白、RNA及上清液，運(yùn)用RT-qPCR方法檢測(cè)TF和IL-8的mRNA的表達(dá)，Xa生成法檢測(cè)TF活性，ELISA方法檢測(cè)IL-8的表達(dá)，Western blotting方法檢測(cè)mTOR、p38、ERK1/2、JNK和NF-κB p65磷酸化的情況，觀察雷帕霉素對(duì)抗β2

9、GPI抗體/β2GPI或APS-IgG/β2GPI誘導(dǎo)單核細(xì)胞mTOR、p38、ERK1/2、JNK和NF-κB p65活化的影響。
　　(6)THP-1細(xì)胞先采用p38抑制劑(SB203580，10μM)、ERK1/2抑制劑(U0126，5μM)、JNK1/2抑制劑(SP600125，90rnM)、NF-κB抑制劑(PDTC，20μM)和TLR4抑制劑(TAK-242，5μM)預(yù)處理2h后，再用抗β2GPI抗體/β2GPI或AP

10、S-IgG/β2GPI復(fù)合物處理一段時(shí)間后，收集細(xì)胞總蛋白，Western blotting方法檢測(cè)mTOR磷酸化情況，觀察它們對(duì)抗β2GPI抗體/β2GPI或APS-IgG/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞mTOR活化的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)抗β2GPI抗體和IgG-APS均能顯著增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平，與對(duì)照組NR-IgG比較差異顯著(p＜0.05)。
　

11、　(2)PDTC和姜黃素能分別明顯地減弱抗β2GPI抗體誘導(dǎo)小鼠NF-κBp65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平(p＜0.05)，且二者沒(méi)有共同的抑制效應(yīng)。但發(fā)現(xiàn)姜黃素能明顯降低抗β2GPI抗體誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-κB p65磷酸化水平(p＜0.05)，對(duì)主動(dòng)脈NF-κ B p65磷酸化水平也有微弱地抑制效應(yīng)但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　(3)PDTC或/和姜黃素均能顯著抑制經(jīng)由抗體β2GPI抗體誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈

12、腹腔巨噬細(xì)胞TF活性的升高、胸主動(dòng)脈TF、E-selectin、ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白的表達(dá)增加、腹腔巨噬細(xì)胞TF、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)增加(p＜0.05)，且PDTC顯示最強(qiáng)的抑制效應(yīng)，而二兩者聯(lián)合使用時(shí)沒(méi)有協(xié)同效應(yīng)。
　　(4)抗β2GPI抗體/β2GPI和APS-IgG/β2GPI復(fù)合物均能顯著增加THP-1細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞TF和IL-8的表達(dá)以及mTOR磷酸化水平

13、(p＜0.05)，且對(duì)mTOR磷酸化的影響顯示時(shí)間依賴性，于刺激45 min（THP-1細(xì)胞）和60 min（人外周血單核細(xì)胞）時(shí)磷酸化水平最強(qiáng)。
　　(5)雷帕霉素預(yù)處理THP-1和人外周血單核細(xì)胞20 h后，抗β2GPI抗體/β2GPI或APS-IgG/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)的TF和IL-8的表達(dá)以及mTOR、p38、ERK1/2和NF-κB p65的磷酸化水平均能被明顯地抑制(p＜0.05)，而對(duì)JNK的磷酸化水平無(wú)抑制效應(yīng)(

14、p＞0.05)。
　　(6)抗β2GPI抗體/β2GPI或APS-IgG/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞mTOR的活化能被p38抑制劑SB203580、ERK1/2抑制劑U0126或TLR4抑制劑TAK-24顯著地抑制(p＜0.05)，而JNK抑制劑SP600125或NF-κB抑制劑PDTC無(wú)抑制效應(yīng)(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)在EAPS模型小鼠體內(nèi)，NF-κB和c-Jun/AP-1參與介導(dǎo)抗β2GP

15、I抗體誘導(dǎo)小鼠TF、粘附分子（E-selectin、ICAM-1和VCAM-1）和炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá)，表明NF-κB和c-Jun/AP-1在aPL誘導(dǎo)的促血栓、促炎癥狀態(tài)中發(fā)揮著極其重要的作用。
　　(2)體外研究發(fā)現(xiàn)，mTOR參與介導(dǎo)了抗β2GPI抗體/β2GPI或APS-IgG/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)單核細(xì)胞TF和IL-8的表達(dá)，TLR4、p38和ERK1/2能夠調(diào)節(jié)mTOR的活化，表明mTOR在