攜Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗雙配體超聲微泡在高剪切力下靶向粘附性能的評價.pdf

1、背景和目的：
　　 血管內皮炎癥已被證實與許多心血管疾病,如動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、高血壓等的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。如能無創(chuàng)性地對“血管炎癥”進行靶向分子成像,無疑可為臨床早期診斷心血管疾病提供非常有價值的手段,進一步指導早期的干預、治療。因此,現(xiàn)有的許多無創(chuàng)性影像技術,如:超聲、MRI、CT、SPECT等均在對“血管炎癥”的靶向分子成像進行積極探索。
　　 靶向超聲分子成像作為近年興起的一門無創(chuàng)性分子影像

2、技術,是通過在超聲微泡表面連接特異性配體構建靶向微泡,以靶向微泡作為示蹤劑,經靜脈注入后與血管內皮細胞表面特異性靶向分子有效結合,再通過對局部靶向粘附的微泡行超聲對比成像,特異性評價血管內皮細胞上分子學變化,從而實現(xiàn)疾病分子水平上特異診斷的目的。與其他依靠解剖結構和組織生理學改變來發(fā)現(xiàn)和診斷疾病的傳統(tǒng)影像學技術相比較,超聲分子成像技術具有實時、高空間、時間分辨率,無放射污染,儀器便攜、價廉等先進性。
　　 許多研究表明,血管內皮

3、細胞功能異常作為血管炎癥反應過程必要的參與因素,是以內皮細胞表面P-(platelet-selectin)、E-(endothelial-selectin)和L-(leukocytes-selectin)選擇素,血管粘附分子VCAM-1(vascular adhesionmolecule-1)和細胞間粘附因子ICAM-I(intracellular adhesion molecule-1)等的明顯上調為特征的。這些粘附因子介導炎癥細胞實

4、現(xiàn)在血管內皮表面滾動、牢固結合及向內皮下遷移,其表達往往具有區(qū)域特異性和特異疾病關聯(lián)性。若能實現(xiàn)對這些異常表達粘附因子的靶向檢測,有望在早期評價血管炎癥反應和相關疾病。而超聲分子影像技術可通過在超聲微泡表面連接與內皮特異因子靶向結合的配體,介導微泡與靶分子有效結合,再行對比超聲成像,具有對“血管炎癥”進行靶向分子成像的潛能。
　　 毫無疑問,靶向超聲微泡與血管內皮表面靶分子的有效結合是實現(xiàn)超聲分子成像的核心和關鍵,而靶向微泡表面

5、配體的選擇對其粘附效能具有重要的影響。目前常用的靶向超聲微泡主要是通過主動性靶向機制,采用具有脂質外殼含惰性氣體的微泡在其表面上裝配特異性配體來實現(xiàn)?？贵w、多肽和多糖等多種分子物質均可作為配體與超聲微泡連接構建成特異的靶向性超聲微泡。國內外已有許多研究通過在微泡表面攜帶與血管粘附因子特異性結合的單克隆抗體構建靶向超聲微泡,成功實現(xiàn)了對血栓、心臟缺血再灌注等血管炎癥相關性疾病的超聲分子影像評價。但是,由于大部分抗體與靶分子的結合和解離速率

6、低、作用過程相對緩慢,形成牢固結合需要一定的接觸時間,而血流速度快、剪切應力大,微泡與靶分子的接觸時間短暫,在尚未形成牢固結合前可被血流沖刷脫離而難以達到高效結合,這使得應用攜帶單一抗體的靶向超聲微泡目前僅能對血流速度慢、剪切應力小的靜脈系統(tǒng)疾病進行良好靶向超聲分子影像評價,嚴重限制了靶向超聲分子成像技術在動脈系統(tǒng)中的應用,而大多數(shù)與心血管疾病相關的病理過程都發(fā)生在動脈中。
　　 因此,要實現(xiàn)超聲微泡在動脈系統(tǒng)有效的靶向結合需要

7、微泡在高剪切應力下具有與靶分子快速粘附和牢固結合的特點。若能利用具有靶向誘導作用的“雙配體”連接技術,設計在同一超聲微泡上連接兩種配體,一種是可與靶分子快速結合的配體,另一種是可與靶分子穩(wěn)定結合的配體,有望實現(xiàn)高剪切應力下微泡的有效靶向結合。
　　 近期發(fā)現(xiàn)一種非抗體型的配基Sialyl Lewisx能與選擇素快速但不十分牢固地結合,于炎癥早期介導白細胞在血管內皮表面滾動,它可以為某些緩慢結合型配基形成牢固結合提供機會。因此,本

8、實驗通過構建同時攜Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗的雙配體靶向超聲微泡,利用平行板流動腔評價其在高剪切應力下的靶向黏附行為特征和粘附效能,并在小鼠腹主動脈炎癥模型上,結合對比超聲評價其分子成像效果,探討具有靶向誘導作用特點的“雙配體”能否介導靶向微泡實現(xiàn)從滾動到牢固黏附的高效結合,為發(fā)展在高剪切應力下具有更好黏附效能的靶向超聲微泡構建技術,進而開拓超聲分子影像技術在評價動脈炎癥反應中的應用領域提供可行性指導。
　　 方

9、法
　　 1、生物素化脂質超聲微泡的制備:將各種脂質材料及輔助材料(DSPE-PEG2000-Biotin、DPPC、PEG4000等)按一定比例加入適量蒸餾水中水浴溶解后,通入全氟丙烷(C3F8)氣體,剪切儀高速剪切至形成乳白色液體制備生物素化脂質微泡,靜置、洗滌、純化3次后,顯微鏡下觀察并利用庫爾特計數(shù)儀檢測其大小及濃度。
　　 2、靶向超聲微泡的制備:生物素化的脂質超聲微泡制備后,加入一定量的抗生蛋白鏈菌素,靜置后

10、洗滌、純化3次,分別按1×107個微泡1.5μg、7.5μg和7.5μg比例依次加入Sialyl Lewisx、P-選擇素單抗、同型對照單抗制備分別攜Sialyl lewisx(Selectin-targeted microbubbles,MBS)、P-選擇素單抗(P-selectin—targeted microbubbles,MBP)和同型對照單抗(isotype controlmicrobubbles,MBC)三種靶向超聲微泡,并

11、按1×107個微泡加入0.75μg SialylLewisx和3.75μg P-選擇素單抗比例同時加入兩種配體制備出攜Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗的雙配體靶向超聲微泡(Dual-liglands microbubbles,MBD),每種微泡制備后靜置、洗滌、純化3次,經庫爾特計數(shù)儀檢測其大小及濃度。
　　 3、靶向超聲微泡的體外鑒定:每種靶向微泡均取5×106個稀釋至1ml,與Sialyl Lewisx抗體(CD1

12、5s)作用后,同時與FITC(綠色)標記的抗大鼠二抗和TRITC(紅色)標記的抗小鼠二抗孵化,洗滌、純化后連續(xù)于顯微鏡常光、紅色和綠色光譜的光照作用下觀察拍照；并以MBC作對照,用流式細胞儀檢測MBS、MBP和MBD的配體結合率。
　　 4、平行板流動腔法體外評價超聲微泡的靶向粘附性能:配備濃度為1μg/ml的小鼠P-選擇素FC段溶液,按200μl/個滴加在每個培養(yǎng)皿中央進行包被。
　　 4.1、結合實驗:利用平行板流動

13、腔分別設定0.5、2.0和4.0 dyn/cm2三種剪切應力。同一剪切應力下,每種微泡(約5×106個/ml)分別經微量注射泵作用通過平行板流動腔,顯微鏡下錄像觀察6分鐘。
　　 4.2、解離實驗:每種微泡(約5×106個/ml)取1ml,分別注入平行板流動腔培養(yǎng)皿后靜置5分鐘,先以0.9％生理鹽水以0.2 dyn/cm2剪切力沖洗掉靜止但未結合的微泡,至鏡下無游離的微泡后,每30秒增加一次剪切應力,至鏡下微泡完全解離。

14、　　 4.3、利用image-pro-plus圖像分析軟件,分析每種剪切引力下瞬時滾動的微泡數(shù)目、6分鐘時視野內牢固結合的微泡數(shù)目和解離實驗中每次剪切應力增加后30秒視野內仍牢固結合的微泡數(shù)目。
　　 5、小鼠腹主動脈炎癥模型的制備:12只小鼠隨機平均分為炎癥組和對照組,炎癥組小鼠在腎動脈分支至髂動脈分叉之間的腹主動脈周圍注入含0.5μgTNF-α和0.125μg IL-1β的0.3 ml PBS溶液,對照組小鼠只注入0.3

15、ml PBS溶液,回置腸腔,縫合切口關閉腹腔作用4小時。
　　 6、靶向超聲分子成像:制備的小鼠采用經尾靜脈隨機注射MBC、MBS、MBP和MBD(5×107個)(兩次注射間隔30分鐘),6分鐘后行對比超聲檢查觀察腹主動脈的顯影情況,并采用MCE軟件對所得圖像進行分析,測量小鼠腹主動脈造影聲強度(video intensity,VI),編輯主動脈顯影的彩色編碼圖像。
　　 7、病理組織和免疫組化染色檢查:超聲分子成像結束

16、后,立即處死小鼠取腹主動脈分別行HE染色和免疫組化染色。
　　 結果
　　 1、靶向微泡的制備:顯微鏡下觀察MBC、MBS、MBP和MBD均為分布均勻,大小均一的透亮氣泡,應用庫爾特計數(shù)儀測得四種微泡的平均粒徑分布為(2.182-2.378)μm,平均濃度分布為(1.239-1.341)×108個/ml,四種微泡平均粒徑比較(F=0.874,P=0.494)和平均濃度比較(F=0.047,P=0.985)均無顯著差異。<

17、br>　　 2、靶向微泡的體外鑒定:每種微泡均采用FITC標記的羊抗大鼠二抗和TRITC標記的羊抗小鼠二抗孵化并洗滌純化后,在熒光顯微鏡下觀察示,MBC未呈現(xiàn)熒光,MBS只有明顯的紅色熒光,MBP只呈明顯的綠色熒光,而MBD在對應光照作用下分別呈現(xiàn)均勻明顯的紅色和綠色熒光；以MBC作為對照,經流式細胞儀測得,MBS、MBP和MBD的配體結合率均在80％以上,三者比較無顯著差異(F=1.773,P=0.248)。以上均表明利用“生物素-

18、親和素”橋接技術可使配體與脂質微泡有效連接,成功構建雙配體靶向微泡和其他同型對照微泡。
　　 3、平行板流動腔法評價微泡的靶向粘附性能
　　 3.1、結合實驗顯示:將MBC、MBS、MBP,和MBD分別在0.5、2.0和4.0 dyn/cm2剪切應力下通過表面包被相同濃度小鼠P-選擇素FC段溶液的平行板流動腔時,可觀察到除MBC少量滾動和粘附外,MBS、MBP和MBD的滾動和結合數(shù)目均較多。在相同剪切應力下,MBS、MB

19、P和MBD的瞬時滾動數(shù)目和全程(6分鐘)結合數(shù)目均明顯高于MBC(P<0.01)。MBC的瞬時滾動數(shù)目在不同剪切應力下無顯著差異(F=4.287,P=0.070),全程結合數(shù)目在4.0 dyn/cm2時均較0.5和2.0dyn/cm2時減少(F=6.833,P=0.028)；而MBS、MBP和MBD的瞬時滾動數(shù)目和全程結合數(shù)目均隨剪切應力的提高而減少(P<0.05)。其中,在剪切應力為0.5dyn/cm2時示:MBS、MBP和MBD的瞬

20、時滾動數(shù)目比較和全程結合數(shù)目比較均無顯著差異(P>0.05)；在2.0 dyn/cm2時示:MBS和MBD的瞬時滾動數(shù)目均高于MBP(MBS較MBP:P=0.047:MBD較MBP:P=0.002),而前兩者比較無顯著差異(P=0.262)；全程結合數(shù)目由少至多依次為MBP、MBS和MBD(P<0.05)。在4.0 dyn/cm2時示:MBS和MBD的瞬時滾動數(shù)目均高于MBP(MBS較MBP:P=0.003；MBD較MBP:P=0.01

21、5),而前兩者比較無顯著差異(P=1.000)；MBD的全程結合數(shù)均明顯高于MBS和MBP(MBD較MBS:P=0.018；MBD較MBP:P=0.001),后兩者比較無顯著差異(P=0.455)。以上表明在平行板流動腔中,MBS、MBP和MBD均可抵抗一定剪切應力流體的沖刷,對P-選擇素實現(xiàn)靶向結合,且MBD在較高剪切應力下顯示出優(yōu)于MBS和MBP的靶向結合效能。
　　 3.2、解離實驗顯示:在包被相同P-選擇素濃度的平行板流

22、動腔內注入1 ml的微泡后,靜置5分鐘待其與靶分子靶向結合后,每30秒增加一次剪切應力,常光顯微鏡下觀察可見,MBC、MBS、MBP和MBD仍結合于平行板流動腔表面的數(shù)目隨著剪切應力的增加而減少；其中,MBC不能與P-選擇素穩(wěn)定結合,在較低剪切應力下即可見明顯的解離,MBS、MBP和MBD的結合相對穩(wěn)定,能抵擋一定剪切應力的沖刷作用。圖像定量分析后顯示:MBC、MBS、MBD和MBP的半數(shù)解離剪切應力依次增高,分別為(4.133±0.8

23、3)、(10.20±0.87)、(19.20±1.4)和(29.40±3.54)dyn/cm2(F=91.374,P=0.000)。僅在(14.20±2.82)dyn/cm2時MBC就達到完全解離,而MBS、MBD和MBP的完全解離剪切應力依次為(29.40±4.26)(67.06±5.46)和(101.80±3.54)dyn/cm2,三者比較依次增高(F=271.389,P=0.000)。表明靶向微泡與靶分子結合后能夠抵擋一定剪切應力

24、的沖刷,其中MBS為不穩(wěn)定結合,MBD結合相對牢固,而MBP一旦結合就十分牢固,能夠抵擋高剪切應力的沖刷。
　　 4、靶向超聲分子成像:分別隨機經尾靜脈注射MBC、MBS、MBP和MBD)6分鐘后,在對照組小鼠腹主動脈中均未見明顯的超聲顯影,在炎癥組小鼠腹主動脈中除MBC無明顯超聲顯影外,MBS、MBP和MBD可呈現(xiàn)不同程度相對明顯的超聲顯影,其中MBD的顯影較MBS和MBP明顯增強。
　　 5、超聲圖像定量分析:對采集

25、的超聲圖像進行VI定量分析后顯示,除MBC外(t=0.099,p=0.923),MBS、MBP和MBD在炎癥組小鼠中腹主動脈中的VI值均高于對照組(MBD:t=9.363,p=0.000；MBP:t=6.841,p=0.000；MBD:t=8.246,p=0.000)。其中,在對照組中,MBC、MBS、MBP和MBD的VI值無顯著差異(F=1.199,P=0.336)；而在炎癥組中,MBS、MBP和MBD的VI值均明顯高于MBC(F=3

26、6.349,P=0.000),且MBD較MBS、MBP顯著增加(P<0.05),后兩者間無顯著差異(P>0.05)。
　　 6、病理組織和免疫組化染色結果
　　 6.1、HE染色顯示:對照組小鼠腹主動脈無明顯病理改變,中外膜結構清晰,內皮扁平光滑；炎癥組小鼠腹主動脈壁水腫增厚,內皮皺縮凸向管腔,管腔狹窄,中膜可見平滑肌細胞增生、排列紊亂,部分遷入內膜下,彈性蛋白收縮明顯,增生斷裂、散落在外膜內。
　　 6.2、免

27、疫組化染色顯示:對照組小鼠腹主動脈內皮P-選擇素表達均為陰性,而炎癥組小鼠腹主動脈內皮均可見P-選擇素表達,表明小鼠腹主動脈炎癥模型構建成功。
　　 結論
　　 1、采用“生物素-親和素”橋接技術可實現(xiàn)Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗與脂質微泡外殼的有效連接,成功構建攜Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗的雙配體靶向超聲微泡和同型對照單配體靶向超聲微泡。
　　 2、MBS、MBP和MBD在體外均能