溶藻弧菌誘導(dǎo)紅笛鯛仔魚差減文庫(kù)的構(gòu)建及其表達(dá)序列標(biāo)簽分析.pdf

1、本論文以滅活溶藻弧菌誘導(dǎo)的紅笛鯛仔魚為研究對(duì)象,選擇仔魚母源抗體完全降解,而其自身免疫尚未完全建立這段“特異性免疫應(yīng)答無(wú)能期”,通過(guò)抑制消減雜交技術(shù)(SSH),構(gòu)建了誘導(dǎo)組和對(duì)照組的cDNA差減文庫(kù),并對(duì)與紅笛鯛仔魚抗菌免疫和免疫系統(tǒng)成熟相關(guān)功能基因的表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)進(jìn)行了分析。
　　 本研究以滅活溶藻弧菌(1.0×108 cfu/mL)浸泡的紅笛鯛仔魚cDNA為tester,以PBS浸泡的紅笛鯛仔魚cDNA為drive

2、r,利用抑制性差減雜交技術(shù)構(gòu)建cDNA差減文庫(kù)。經(jīng)檢測(cè)文庫(kù)容量為2×106個(gè)克隆,藍(lán)白斑檢驗(yàn)表明重組率為90％,PCR檢測(cè)表明目的片段大多分布在0.3～1.0 kb之間,符合建庫(kù)要求。通過(guò)對(duì)1000個(gè)隨機(jī)篩選的克隆進(jìn)行測(cè)序,共獲得ESTs910個(gè)。BLASTx同源性分析表明:720個(gè)ESTs序列與NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)序列存在顯著的相似性,140個(gè)ESTs序列與NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)序列存在一定相似性,50個(gè)

3、ESTs序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)序列沒有相似性。將BLASTx同源性分析結(jié)果進(jìn)行GO分類可將獲得的ESTs分為以下8類:免疫防御應(yīng)激類(7個(gè)ESTs,占1％)、細(xì)胞骨架類(34個(gè)ESTs,占4％)、核糖體類(258個(gè)ESTs,占29％)、細(xì)胞代謝/呼吸鏈類(430個(gè)ESTs,占51％)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/粘附類(43個(gè)ESTs,占5％)、細(xì)胞周期/DNA復(fù)制/蛋白調(diào)控/轉(zhuǎn)錄/翻譯類(25個(gè)ESTs,占3％)、轉(zhuǎn)運(yùn)類(17個(gè)ESTs,占2％)、