多種無機和有機砷化物對Nrf2通路的可能作用.pdf

1、目的：
　　 砷(As)在自然界中分布廣泛，以砷化物的形式存在，砷化物可分為無機砷和有機砷兩大類，各種砷化物的化學性質和特點差異很大且十分復雜。無機砷化物中最常見的是三氧化二砷(As2O3，又稱砒霜)和亞砷酸鈉(NaAsO2)，化學形態(tài)均為三價;此外還有砷酸鈉(Na2HAsO4)，化學形態(tài)則為五價。有機砷化物中，五價的二甲基砷(DMA)是環(huán)境中的主要存在形式。砷化物具有強烈的毒性，并呈現致癌或致畸效應。研究普遍認為，無機砷化物的

2、毒性要遠遠大于有機砷化物，而無機砷中則以三價砷的毒性為最強。盡管已知的砷的毒性均以無機砷為主，但也有研究提示有機砷的毒性不容忽視。
　　 另一方面，核轉錄因子NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor2，Nrf2)是細胞調節(jié)抗氧化應激反應的重要轉錄因子。生理狀態(tài)下Nrf2的轉錄活性處于相對抑制狀態(tài);氧化應激等因素作用下，Nrf2活化后，啟動Nrf2調控的下游靶分子——抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶等基因表達，增強細胞對

3、氧化應激的抵御能力，維持細胞內氧化還原狀態(tài)的平衡和降低氧化損傷。機體內Nrf2及其調控的抗氧化酶HO-1和Ⅱ相解毒酶(NQO1、GST)和GSH相關的抗氧化酶（GCLc、GCLm及GR）都具有直接或間接抗氧化作用，在抗氧化系統(tǒng)和毒物解毒代謝中起著十分重要的作用。
　　 砷在人體內的代謝過程主要在肝臟進行，肝臟具有復雜的抗氧化防御系統(tǒng)，其中Nrf2是肝細胞防御過氧化應激的重要調節(jié)因子。不同砷化物對肝臟系統(tǒng)Nrf2信號通路的研究無疑

4、對深入研究砷的生物學作用具有十分重要的意義。本研究采用Chang肝細胞進行相關實驗，因其分化特征與正常肝細胞相似，且是體外研究砷毒性和作用機制較為合適的細胞模型，因此實驗結果外推至人體更具有現實意義。
　　 綜上所述，本研究擬以Chang肝細胞株為研究對象，探討多種無機砷化物(NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4)和有機砷化物(DMA)對Nrf2及Nrf2通路調控的下游靶分子——抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的mRNA轉錄和蛋白表達

5、的可能影響，并比較不同砷化物對Nrf2通路活化的作用強度和持續(xù)時間、以及對下游靶基因激活的差異等，試圖探討和深入理解多種無機和有機砷化物的不同生物學作用，這將對揭示砷的生物學意義具有重要的現實意義。
　　 研究方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)及染毒
　　 2.Alamar Blue還原法測定Chang肝細胞的增殖活力
　　 3.實時定量PCR法檢測Chang肝細胞內Nrf2及其調控的下游基因的mRNA表達水平<

6、br>　　 4.Western blot法分析Chang肝細胞內Nrf2調控的下游基因的蛋白表達水平
　　 結果：
　　 1.通過Alamar Blue測定還原率表示細胞增殖活力，來反映四種砷化物的毒性，發(fā)現毒性大小依次為As2O3＞NaAsO2＞ Na2HAsO4＞DMA。
　　 2.特定濃度四種砷化物以不同的時間點染毒Chang肝細胞后，發(fā)現細胞Nrf2蛋白表達呈現相似的趨勢，先升高后降低，6h為蛋白表達最

7、大時間點。
　　 3.無機砷化物染毒后，細胞的Nrf2 mRNA水平表現出相似的趨勢，隨著染毒濃度的升高，Nrf2 mRNA水平均顯著增加且與對照組相比;而有機砷化物DMA染毒時，染毒組與對照組相比，Nrf2 mRNA水平幾乎沒變化。
　　 4.四種砷化物以不同的濃度染毒Chang肝細胞6h后，發(fā)現細胞Nrf2調控基因HO-1、NQO1、GSTO-1、GSTO-2、GCLc、GCLm、GR mRNA水平呈現出隨著濃度升高

8、而上升的趨勢，但各個基因的表達并不相同。
　　 5.不同濃度的無機砷染毒Chang肝細胞6h后，發(fā)現細胞Nrf2調控的蛋白表達趨勢相同，隨著染毒濃度的升高，HO-1、NQO1、GCLc和GCLm的蛋白表達水平逐漸增加;GST和GR的蛋白表達與染毒濃度無關，三個組都表達且相同;而有機砷DMA正好相反，隨著染毒濃度的升高，GST和GR的蛋白表達水平逐漸增加，HO-1、NQO1、GCLc、GCLm的蛋白表達水水平與染毒濃度無關，染毒組