參與LPS-TLR4-MyD88信號(hào)通路的新型介導(dǎo)分子的研究.pdf

1、TRAF6蛋白在LPS/TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴型的信號(hào)通路中起核心的作用，目前已有報(bào)道TAK1作為TRAF6的下游底物，與TAB1/TAB2/TAB3形成復(fù)合物，進(jìn)而激活NF-kB、MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞炎癥因子的釋放。但是，隨后有實(shí)驗(yàn)室利用最新基因敲除技術(shù)在小鼠或細(xì)胞水平敲掉TAK1、TAB1、TAB2，MEKK3等基因后，用LPS刺激誘導(dǎo)MyD88依賴型信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)對NF-kB和MAPK信號(hào)通路均沒有影響。因此，在LPS

2、誘導(dǎo)的LPS/TLR4/MyD88信號(hào)通路中，目前對TRAF6下游蛋白及連接NF-kB、MAPK信號(hào)通路的上游這一中間區(qū)域還有待挖掘并找到新型的介導(dǎo)分子。
　　利用CRISPR-CAS9技術(shù)敲除RAW264.7細(xì)胞的TRAF6基因，我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的MyD88依賴型的NF-kB、MAPK信號(hào)通路被抑制，這說明了TRAF6對激活NF-kB、MAPK信號(hào)通路是必不可少的;同時(shí)，在我們得到TAK1-/-、MEKK3-/-、TAK1-/

3、-MEKK3-/-細(xì)胞后，LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NF-kB、MAPK信號(hào)通路的激活都不受到影響，這進(jìn)一步驗(yàn)證了TAK1、MEKK3蛋白在LPS/TLR4/MyD88/TRAF6信號(hào)通路中不是必需的。
　　在TRAF6-/-RAW264.7細(xì)胞里面回補(bǔ)帶有3*flag標(biāo)簽的TRAF6質(zhì)粒，得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，結(jié)合Western Blotting技術(shù)篩出表型與RAW264.7野生型一致的細(xì)胞株。我們通過免疫共沉淀方法，再借助質(zhì)譜技術(shù)，找到了

4、兩個(gè)可能參與LPS/TLR4/MyD88/TRAF6信號(hào)通路新的介導(dǎo)分子，Nik和Rltpr。Nik又稱絲裂原活化蛋白激酶3K14，目前報(bào)道它主要參與促進(jìn)NFKB2/P100的蛋白水解而參與非經(jīng)典途徑NF-kB的激活;Rltpr蛋白，主要由富含亮氨酸重復(fù)序列，脯氨酸序列和類似原肌球調(diào)節(jié)蛋白序列構(gòu)成，參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)作用。我們同樣利用CRISPR-CAS9技術(shù)，分別敲除野生型RAW264.7細(xì)胞的Nik和Rltpr基因，篩選出單克隆Nik