小膠質細胞活化產物對原代培養(yǎng)大腦皮質神經元調亡的影響.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(Diffuse axonal injury，DAI)是一種原發(fā)性彌漫性腦損傷，是最重要的腦創(chuàng)傷類型之一，是引起死亡、嚴重致殘及植物生存的主要原因。β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，β-APP)的免疫組織化學染色是診斷DAI的金標準。正常情況下微量的β-APP沿著軸索通過快速順行軸漿運輸至突觸。β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)是β-APP通過蛋白水解作用后產生的一段淀

2、粉樣肽。當軸索發(fā)生損傷后，軸漿運輸中斷，從而導致β-APP的積聚并在軸突和胞體中大量表達，大量的Aβ由于β-APP酶解作用的上調而聚集在神經元的核周體，聚集的Aβ具有毒性作用，并可以激活小膠質細胞。
　　大量研究己證實，DAI后的神經損害不僅發(fā)生在損傷瞬間，且在其后的數(shù)分鐘到數(shù)天內還可出現(xiàn)神經元延遲性死亡。目前關于理解DAI發(fā)病過程相關的病理級聯(lián)反應已經有了明顯的進展，然而其形成機制尚不完全明確，是法醫(yī)學和神經科學亟待解決的難題。

3、在DAI的發(fā)病過程中，不僅表現(xiàn)為外力直接作用引起的神經元受損和死亡，同時也存在神經元凋亡，細胞凋亡不僅參與了DAI，而且可能在DAI的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。Caspase-3屬半胱天冬蛋白酶家族的一員，又被稱作死亡蛋白酶，caspase-3的活化是損傷誘導凋亡的最后共同通路。實驗研究中，多以caspase-3作為研究指標來評價細胞的凋亡。
　　前期研究表明，在體狀態(tài)下DAI大鼠腦皮質和海馬神經元軸突中有β-APP的積聚，

4、在損傷的軸索周圍觀察到小膠質細胞的聚集和活化，活化的小膠質細胞可以產生大量的炎癥因子，引發(fā)神經元的“二次損傷”，導致神經元凋亡。然而，離體狀態(tài)下，Aβ激活的小膠質細胞釋放的TNFα和IL-1β是否可以引發(fā)大腦皮質神經元凋亡，進而參與神經元的“二次損傷”及其具體機制，尚未見詳細報道。
　　因此，本實驗采用Aβ1-40作用于原代培養(yǎng)的小膠質細胞，應用ELISA和Real Time PCR的方法，通過檢測TNFα和IL-1β含量及其mR

5、NA的表達觀察小膠質細胞活化情況；用激活的小膠質細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)大腦皮質神經元，應用Real Time PCR和Hoechst33258染色的方法分別檢測神經元caspase-3 mRNA的表達和神經元的凋亡率，以探討DAI后小膠質細胞的活化引起神經元損傷的可能機制，為進一步闡明DAI病理生理學機制奠定基礎，為法醫(yī)學實際檢案工作中對DAI損傷的客觀評價提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1原代培養(yǎng)新生24h內SD乳鼠大腦皮質小

6、膠質細胞，用Aβ1-40處理小膠質細胞，隨機分為4組：對照組、Aβ處理組、Aβ+MC組和MC組。對照組不加處理因素，Aβ處理組加入1μMAβ1-40作用于小膠質細胞6h，Aβ+MC組在加入Aβ1-40前30min加入0.2μM米諾環(huán)素(Minocycline，MC)，MC組只加入0.2μM MC。ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中TNFα和IL-1β的含量，Real Time PCR檢測細胞中TNFα和IL-1β mRNA的表達。
　

7、　2原代培養(yǎng)新生24h內SD乳鼠大腦皮質神經元，隨機分為4組：對照組、1/2 Aβ-MCM組、1/4 Aβ-MCM組、1/8 Aβ-MCM組。對照組神經元正常培養(yǎng)，1/2 Aβ-MCM組、1/4 Aβ-MCM組、1/8 Aβ-MCM組分別在神經元培養(yǎng)基中加入1/2、1/4、1/8 Aβ激活的小膠質細胞條件培養(yǎng)基(Aβactivated microglia conditioned media，Aβ-MCM)，每組包括5個不同時相：1h、3

8、h、6h、12h、24h。Real Time PCR檢測各組細胞中caspase-3 mRNA的表達。選取1/2 Aβ-MCM組，采用Hoechst33258染色，觀察神經元的凋亡率。
　　用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示。各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，以最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較，以P＜0.05為有顯著性

9、差異。
　　結果：
　　1 Aβ1-40對小膠質細胞的作用及米諾環(huán)素對其作用的影響
　　應用1μMAβ1-40作用于小膠質細胞6h后，細胞培養(yǎng)上清中TNFα和IL-1β的含量明顯升高，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)；加入0.2μM米諾環(huán)素和Aβ1-40共同作用于小膠質細胞后，明顯抑制了TNFα和IL-1β的升高，與Aβ處理組相比明顯下降。
　　應用1μM Aβ1-40作用于小膠質細胞6h后，小膠質細胞中

10、TNFα、IL-1βmRNA的表達明顯升高，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)；加入0.2μM米諾環(huán)素和Aβ1-40共同作用于小膠質細胞后，明顯抑制了TNFα、IL-1β mRNA的表達，與Aβ處理組相比明顯下降。
　　2 Aβ-MCM對神經元caspase-3 mRNA表達的影響
　　在神經元培養(yǎng)基中加入1/2量的Aβ-MCM后，各時間點神經元caspase-3 mRNA的表達均升高，與對照組相比均有顯著性差異(P＜

11、0.05)，其中以6h時升高最明顯(P＜0.01)。在神經元培養(yǎng)基中加入1/4量和1/8量的Aβ-MCM，各時間點神經元caspase-3 mRNA的表達與對照組相比均無顯著性差異。
　　3 Aβ-MCM對神經元凋亡率的影響
　　應用Hoechst33258染色觀察神經元的凋亡率，結果顯示，1/2Aβ-MCM處理后各時間點均可見熒光強度較高的凋亡神經元細胞核，并伴有染色質的濃縮、聚集。隨機選取5個視野，300個細胞計數(shù)并進行