鴨坦布蘇病毒E和NSI基因序列分析及其重組蛋白的初步應(yīng)用.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病自2010年4月以來(lái)，在我國(guó)主要養(yǎng)鴨地區(qū)爆發(fā)，該病主要引起肉鴨的神經(jīng)癥狀、產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋量急劇下降，傳播非常迅速，波及范圍較大，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。
　　 為給該病的流行病學(xué)調(diào)查以及后續(xù)疫苗的研制提供免疫效果評(píng)價(jià)的依據(jù)，本研究成功表達(dá)了囊膜蛋白E和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，并分別建立了E蛋白和NS1蛋白間接ELISA檢測(cè)方法，與血清中和試驗(yàn)相比，間接ELISA檢測(cè)方法省時(shí)省力且成本低廉，更適用于大批量樣品檢測(cè)。本研

2、究還對(duì)鴨坦布蘇病毒E基因和NS1基因進(jìn)行了序列分析，為鴨坦布蘇病毒病防控技術(shù)的研究提供了依據(jù)。
　　 本研究主要分為3部分:
　　 1.鴨坦布蘇病毒E基因、NS1基因的序列分析
　　 將E基因和NS1基因的測(cè)序結(jié)果利用DNAstar軟件包MegAlign程序進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)DTMUV的E蛋白與NS1蛋白與登革熱病毒、黃熱病毒等常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的黃病毒的氨基酸同源性較低，僅在48-50％之間，而與1955年從馬

3、來(lái)西亞吉隆坡庫(kù)蚊中分離到的Tembusu virus和2000年從馬來(lái)西亞發(fā)病肉雞中分離到的Sitiawan virus的氨基酸同源性很高，均在93％以上。利用MEGA4.0生物學(xué)軟件分別對(duì)鴨坦布蘇病毒的E基因和NS1基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)，鴨坦布蘇病毒LC-10株與Tembusu virus和Sitiawan virus有較近的親緣關(guān)系，而與登革熱病毒、黃熱病毒等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 2.鴨坦布蘇病毒E

4、基因的原核表達(dá)及初步應(yīng)用
　　 參照GenBank已發(fā)表的鴨坦布蘇病毒基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用PCR方法從鴨坦布蘇病毒山東分離株（LC-10株）擴(kuò)增出整個(gè)E基因，全長(zhǎng)1503bp，將其克隆到pMD18-T載體中，然后將雙酶切的目的片段亞克隆入pET-28a(+)載體，成功構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒PET28a-E。將PET28a-E轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)出約58KD的蛋白，經(jīng)Western blotti

5、ng分析呈陽(yáng)性，表明E蛋白具有很好的反應(yīng)原性。（楊少艷等，2012以純化的E蛋白作為包被抗原，鴨坦布蘇病毒血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG作為二抗建立間接ELISA方法。采用該方法對(duì)80份送檢鴨血清進(jìn)行檢測(cè)，并與中和試驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，兩者符合率為95.0％，表明該方法具有較好的應(yīng)用前景(楊少艷等，2012)。
　　 3.鴨坦布蘇病毒NS1蛋白的原核表達(dá)及初步應(yīng)用
　　 黃病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是在病毒感染細(xì)胞

6、時(shí)產(chǎn)生的，因此可利用NS1蛋白來(lái)區(qū)分自然感染和滅活苗免疫產(chǎn)生的抗體。故本研究參照GenBank已發(fā)表的鴨坦布蘇病毒基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒的NS1基因，利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)鴨坦布蘇病毒的NS1蛋白進(jìn)行重組表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出分子量約為43KD的蛋白，Western blotting分析呈陽(yáng)性，說(shuō)明表達(dá)的NS1蛋白有很好的反應(yīng)原性。利用純化的NS1蛋白作為包被抗原，以鴨坦布蘇病毒陽(yáng)性血