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文檔簡介
1、實驗室利用農桿菌介導遺傳轉化(Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation; ATMT)技術,構建了灰葡萄孢的T-DNA插入突變體庫。通過篩選該ATMT突變體庫,獲得了一株不產生菌核的突變體BCt41,利用TAIL-PCR、PCR、Southern blotting、 RT-PCR等技術,確定了其突變基因為編碼一個功能未知的假定蛋白BcADR1。為進一步明確BcADR1基因在灰葡萄孢生
2、長發(fā)育和致病過程中的功能及其調控機制,本研究利用RT-PCR和Real-time PCR技術,對BcADR1基因的表達規(guī)律進行分析;利用基因互補回復技術,構建了BcADR1基因的互補回復突變體BCt41/BcADR1;通過對野生型BC22、突變體BCt41和回復突變體BCt41/BcADR1的表型和致病力分析,確定了BcADR1基因對病菌生長發(fā)育和致病力的調控功能。通過對野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt41和回復突變體BCt4
3、1/BcADR1的胞壁降解酶活性、毒素活性、產酸能力、穿透能力和附著胞形成、致病相關基因的表達、響應逆境脅迫的能力等進行分析,探討B(tài)cADR1基因調控病菌生長、發(fā)育及致病力的機制。為闡明灰葡萄孢的生長、發(fā)育和致病力的調控機制奠定基礎。
1.利用RT-PCR和Real-time PCR技術,檢測野生型BC22的菌絲、分生孢子和菌核中BcADR1基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn),BcADR1基因在病菌菌絲中的表達水平較高,而在分生孢子和菌
4、核中未檢測到該基因的表達。
2.構建了BcADR1基因的互補回復載體pBARKS1-BcADR1-GFP,利用PEG介導的遺傳轉化技術轉化T-DNA插入突變體BCt41的原生質體,利用草胺膦篩選轉化子,通過PCR、Southern blotting和Real-Time PCR等技術對所獲得轉化子進行鑒定。確定了所獲得的草胺膦抗性轉化子為BcADR1的互補回復突變體BCt41/BcADR1。
3.以灰葡萄孢野生型菌株(
5、BC22)為對照,對T-DNA插入突變體BCt41和回復突變體(BCt41/BcADR1)進行表型和致病力分析,發(fā)現(xiàn)BCt41的生長速率較野生型和回復突變體明顯減慢,菌絲纖細、顏色淺,不產生菌核,產孢量明顯增強,細胞壁較厚、且胞外分泌物;且BCt41的致病力明顯減弱。表明BcADR1正調控灰葡萄孢的菌核產生、菌絲生長和致病力,負調控灰葡萄孢分生孢子的形成。
4.與野生型BC22和回復突變體(BCt41/BcADR1相比,T-D
6、NA插入突變體BCt41的果膠甲基反式消除酶(PMTE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、纖維素酶(Cx)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和乳糖醛酸酶(PG)的活性明顯降低。突變體BCt41的毒素活性較野生型和回復突變體明顯降低;產酸能力明顯減弱。表明BcADR1突變影響灰葡萄孢胞壁降解酶活性、毒素活性、產酸能力。
5.對野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt41和回復突變體(BCt41/BcADR1)的穿透能力和附
7、著胞形成進行分析,發(fā)現(xiàn)3個菌株均能穿透玻璃紙,在PDA培養(yǎng)基上產生菌落;而突變體BCt41產生的附著胞與野生型和回復突變體明顯不同。表明BcADR1突變影響灰葡萄孢附著胞的形成、但不影響其穿透能力。
6.利用Real-time PCR技術,檢測野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt41和回復突變體BCt41/BcADR1中致病相關基因的表達水平。發(fā)現(xiàn)BCt41突變體中Bcg2、BcReg1、PkaR、Bac、Bcp1、Bm
8、p1、Bcg3、Sod1和Bos1基因表達水平較野生型和回復突變體明顯增強。表明灰葡萄孢BcADR1負調控這些致病相關基因的表達。
7.檢測野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt41和回復突變體BCt41/BcADR1對NaCl、KCl、氟康挫和CFW的敏感性,結果發(fā)現(xiàn)T-DNA插入突變體BCt41在NaCl、KCl的培養(yǎng)基上生長速率較野生型和回復突變體明顯降低;BCt41突變體在氟康挫和CFW的培養(yǎng)基上明顯受到抑制。表明
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