轉錄因子MEF2A、KLF2在血管性疾病中的臨床和基礎研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　一、轉錄因子MEF2A基因突變與中國冠心病家系研究
　　目的：
　　1.根據冠心病、心肌梗死的診斷標準，在中國早發(fā)冠心病人群中篩選合適病例，進行家系調查，選擇理想的CAD/MI家系;
　　2.研究分析冠心病家系的遺傳特征、傳統(tǒng)危險因素、脂類代謝情況、冠狀動脈病變情況;
　　3.進行家系全基因組連鎖分析，篩選CAD/MI候選基因，基因測序，尋找有意義的基因突變;
　　4.

2、研究中國冠心病家系中MEF2A基因第1-11外顯子的基因突變情況，與散發(fā)冠心病及健康人群對照，分析MEF2A基因突變與我國CAD/MI家系的關系。
　　方法：
　　1.通過病案檢索臨床診斷明確的早發(fā)冠心病患者，進行家系調查，篩選符合顯性遺傳特征的家系作為研究對象。研究采用的冠心病或心肌梗死的診斷標準為下述條件中至少存在兩個:(1)胸痛;(2)心電圖改變符合急性心肌梗死演變并與心肌酶/肌鈣蛋白顯著升高相一致;(3)冠狀動脈CT

3、或冠狀動脈造影血管腔直徑狹窄率超過50％。通過篩選，確定研究家系。所有的家系成員均進行體格檢查、血液分析檢驗（血常規(guī)、肝腎功、血糖、血脂及血離子分析）、冠狀動脈病變評估，并進行標準化的隨訪，包括病史、活動耐力、藥物史和個人的生活習慣。
　　2.收集以首發(fā)心肌梗死入院并行冠狀動脈造影檢查證實血管病變的散發(fā)冠心病患者(n=311)作為散發(fā)CAD對照組;健康對照組(n=323)是經過冠脈造影或冠狀動脈CT排除冠心病的健康人群，且無早發(fā)冠

4、心病家族史。
　　3.微陣列比較基因組雜交(aCGH)分析:利用全血DNA提取試劑盒提取所有受試者的基因組DNA。aCGH分析冠心病家系中CAD/MI患者樣本中的DNA，正常人基因組DNA作為一個參考，我們用間隔5-kb的寡核苷酸微陣列高精度覆蓋整個基因組，拷貝數變異由患者cDNA樣本與正常對照之間log2比值確定。
　　4.MEF2A基因檢測:采用Taq DNA聚合酶擴增所有家系成員MEF2A基因所有外顯子和內含子-外顯子

5、邊界區(qū)域。引物序列包括MEF2A基因外顯子1-11。利用單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP)分析PCR擴增產物，出現異常條帶的PCR產物克隆到pGEM T easy載體擴增，使用ABI3100遺傳分析儀測序，與CAD對照組、正常對照組測序結果進行對照分析。
　　結果：
　　1.成功篩選并確定了一個有34個家庭成員（5人死亡）的CAD/MI大家系，共包括20名女性和14名男性，該家系四代均無近親婚配。先證者是一名女性，36歲發(fā)病，冠

6、狀動脈造影(CAG)顯示嚴重前降支病變，狹窄超過80％，無吸煙、高血壓、糖尿病及高脂血癥，符合早發(fā)冠心病診斷。此家系共發(fā)現7名現存活的CAD/MI患者，包括先證者的母親、兩個姐姐，一個哥哥、表哥和侄女均有早發(fā)冠心病(PCAD)癥狀及表現。
　　2.家系成員CAD危險因素分析示:家庭中僅有幾個成員有血清總膽固醇和甘油三酯輕度升高，但血清低密度和高密度脂蛋白均正常，家庭成員均沒有吸煙、高血壓病、糖尿病和肥胖病史。多元Logistic回

7、歸分析家系成員的年齡、體重指數、膽固醇、甘油三酯水平、空腹血糖等因素與CAD/MI均無相關性。
　　3.家系具有以下遺傳特點:我們分析該家系的CAD/MI遺傳特點為:發(fā)病不分男女性別，符合常染色體遺傳;4代人均有發(fā)病，第3代患病人數達55.6％(5/9)，患者雙親中必有一方也患病，正常親屬后代未發(fā)病，這些特點符合顯性遺傳特點。
　　4.微陣列CGH分析:家系中7例CAD/MI患者的染色體15q26中都存在50-kb的片段染色

8、體拷貝數差異(log2 ratio means＜-0.3)，這一區(qū)域包含11個重要的基因(POTEB, CXADRP2, LOC646214, GOLGA8C, OR4M2, OR4N4, LOC650137, MEF2A,OR4F4,WASH3P and FAM138E)，經文獻檢索發(fā)現其中只有MEF2A基因與CAD的發(fā)病相關，MEF2A成為最強的候選基因。
　　5.MEF2A基因檢測:(1)在家系的所有成員MEF2A基因的第1

9、、2、3、4、5、6、7、8、9、10外顯子SSCP分析均未發(fā)現有異常條帶;(2)在家系的所有7個CAD/MI患者和非CAD/MI的5個成員基因檢測均發(fā)現MEF2A第11外顯子存在6個堿基對(CAGCCG)缺失;(3)這6個堿基對(bp)缺失位于MEF2A基因cDNA序列的1671至1676位置;(4)第11外顯子缺失的序列之中含一個CAG序列，其前方還有n個CAG重復序列;(5)家系中沒有6-bp缺失的成員均為正常表型，未發(fā)生CAD，

10、其他存在6-bp缺失而未發(fā)生冠心病的5名家庭成員均未滿40歲;(6) CAD對照組311個CAD患者和正常對照組323健康人的MEF2A基因外顯子11編碼區(qū)域均未發(fā)現6-bp缺失，也未發(fā)現國外研究報道過的21-bp缺失。
　　結論：
　　1.本研究成功篩選出具有顯性遺傳特征的中國冠心病家系，年齡、血壓、吸煙、血脂、血糖、體重指數等常見危險因素與家系成員冠心病發(fā)生無相關性，證明家族遺傳因素是部分人群冠心病發(fā)生的重要原因。

11、>　　2.首次在中國家系研究中發(fā)現一種家族遺傳型冠心病與新發(fā)現的MEF2A基因突變密切相關，這種突變是位于MEF2A基因的第11外顯子6堿基(CAGCCG)缺失，是人類MEF2A基因中發(fā)現一種新的突變類型。
　　3.本研究在散發(fā)CAD及正常對照組人群中未發(fā)現MEF2A基因的第11外顯子6堿基(CAGCCG)缺失以及國外研究報道過的21-bp缺失，我們認為MEF2A基因第11外顯子突變與我國散發(fā)冠心病的發(fā)生無關，可能是部分CAD家系

12、的致病基因。
　　二、轉錄因子KLF2在高糖條件下對血管內皮功能的影響及藥物干預研究
　　目的：
　　通過體外實驗探討轉錄因子KLF2在高糖條件下是否對血管內皮功能具有重要的保護作用，闡明可能的分子機制及干預措施，為防治糖尿病動脈粥樣硬化提供重要治療靶點。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)及存活率測定:
　　離體培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，用不同濃度梯度及時間梯度的高糖干預，MTT比色法測定細胞

13、存活率最終確定高糖誘導HUVEC細胞模型為25.5mmol/L的D-葡萄糖誘導24h。
　　2.細胞干預:
　　采用25.5mmol/L高糖及不同濃度阿托伐他汀、羅格列酮實現對人臍靜脈內皮細胞KLF2表達的干預，以SB203580來抑制p38MAPK活性，分別采用5.6mmol/L葡萄糖、5.6mmol/L葡萄糖+19.9 mM甘露醇干預細胞作對照組。
　　3.RT-PCR:
　　收集各組細胞，提取RNA，進行逆

14、轉錄和定量PCR，分別檢測各組細胞中KLF2、PPARγ、VCAM-1和ICAM-1 mRNA的表達水平。
　　4.Western blotting:
　　收集各組細胞，提取蛋白，分別檢測KLF2、VCAM-1、ICAM-1、p38MAPK、p-p38MAPK、PPARγ的蛋白表達水平。
　　5.NO檢測:
　　收集各組細胞上清液，采用試劑盒檢測NO釋放。
　　結果：
　　1.與5.6mmol/L葡萄

15、糖及5.6mmol/L葡萄糖+甘露醇組對照，25.5mmol/L高糖刺激臍靜脈內皮細胞24h可明顯減低KLF2mRNA及蛋白的表達，增高炎性因子VCAM-1、 ICAM-1水平，減少NO的釋放，KLF2與VCAM-1、ICAM-1、NO變化趨勢顯著相關;
　　2.以阿托伐他汀(0.1μM，1μM，10μM)、羅格列酮(0.1州，1μM，10μM)分別干預高糖刺激的HUVECs能明顯增加KLF2表達和NO的釋放，降低VCAM-1、I

16、CAM-1蛋白和mRNA表達，這種改變在阿托伐他汀組呈劑量依賴性，藥物濃度越高越明顯;
　　3.與對照組比較，高糖刺激后的HUVECs磷酸化的p38 MAPK表達增強，給與p38MAPK特異性抑制劑SB203580后，KLF2的表達增加;中等濃度阿托伐他汀、羅格列酮（1μM）就能明顯抑制高糖對HUVEC p38 MAPK的磷酸化作用。
　　結論：
　　1.高濃度葡萄糖能誘導人臍靜脈內皮細胞的炎癥因子VCAM-1、ICA