化瘀通絡(luò)中藥不同配伍對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟干預(yù)作用及對(duì)腎組織P-cadherin和TRPC6的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病（DKD）是糖尿?。―M）最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，同時(shí)也是導(dǎo)致終末期腎病的第二大病因。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腎小球?yàn)V過(guò)屏障中足細(xì)胞的損傷是導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生的重要因素之一，其上的P-鈣粘素（P-cadherin）和瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道-6（TRPC6）是近期發(fā)現(xiàn)的與蛋白尿產(chǎn)生密切相關(guān)的蛋白。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察化瘀通絡(luò)中藥不同配伍對(duì)DKD大鼠腎臟干預(yù)作用和對(duì)腎組織P-cadherin和TRPC6表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索

2、其可能的作用靶點(diǎn)。
　　方法：將70只雄性SD大鼠，體重約為100±10g，隨機(jī)分為正常組（C組， n=8）和造模組（n=62），采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射法（35 mg/kg）建立糖尿病大鼠模型，72h后三次尾靜脈取血測(cè)隨機(jī)血糖（RBG），均≥16.7 mmol/L者即為模型制備成功，不符合標(biāo)準(zhǔn)者予以剔除。之后將成模的55只大鼠再隨機(jī)分為模型組（M組）、化瘀通絡(luò)中藥組（Q組）、厄貝沙坦組（I組）、

3、化瘀組（H組）和通絡(luò)組（T組），每組11只，灌胃干預(yù)16周。分別于藥物干預(yù)后的第3天、4周末、8周末、12周末、16周末，收集各組大鼠24小時(shí)尿液，測(cè)定24小時(shí)尿量和24小時(shí)尿蛋白定量（24h UTP）；測(cè)量RBG、飲水量、攝食量，觀察其動(dòng)態(tài)變化。在16周末，水合氯醛麻醉大鼠后開(kāi)腹剝離雙側(cè)腎臟，稱(chēng)量腎重（KW）,計(jì)算腎臟肥大指數(shù)（HI）；腹主動(dòng)脈取血待行血液生化指標(biāo)檢測(cè)；留取腎組織，待行光鏡、電鏡觀察，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法（IHC）、實(shí)時(shí)

4、定量PCR（Real-time PCR）和蛋白印跡法（Western Blot）進(jìn)行mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠的一般情況:C組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)靈活，攝食飲水尿量無(wú)異常，體重平穩(wěn)增加。M組則精神逐漸萎靡，多飲多食多尿，體重較前減少。各治療組較M組，上述癥狀不同程度緩解。
　　2.不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠24小時(shí)攝食量、飲水量、尿量動(dòng)態(tài)變化:與同一時(shí)間點(diǎn)C組相比，各造模組24小時(shí)攝食量、飲水量和

5、尿量顯著增加；與同一時(shí)間點(diǎn) M組比較，各治療組攝食量在任何時(shí)間點(diǎn)均無(wú)差異；飲水量和尿量在第16周出現(xiàn)差異，與同時(shí)間點(diǎn)M組比較，Q組和T組24小時(shí)飲水量和尿量均減少，I組和H組無(wú)明顯變化。
　　3.各組大鼠腎重、體重及腎臟肥大指數(shù)比較:各組大鼠腎重間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與 C組相比，各造模組體重顯著降低，腎臟肥大指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與 M組比較，Q組體重升高，腎臟肥大指數(shù)降低，則I組、H組和T組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4

6、.各組大鼠24h UTP比較:第3天，各組大鼠24h UTP組間無(wú)差異。
　　第4周末，與C組比較，各造模組大鼠24h UTP均上升，而各治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第8周末，與C組比較，各造模組大鼠24h UTP均上升；與M組比較，Q組和I組大鼠24h UTP下降，H組和T組無(wú)差異。
　　第12周末，與C組比較，各造模組大鼠24h UTP均上升；與M組比較，各治療組大鼠24h UTP均下降。
　　第16周末，

7、與C組比較，各造模組大鼠24h UTP均上升；與M組比較，各治療組大鼠24h UTP均下降；與I組比較，Q組下降；與Q組比較，H組和T組稍高。
　　5.各組大鼠隨機(jī)血糖、血脂比較:不同時(shí)間點(diǎn)C組大鼠RBG基本穩(wěn)定；各造模組RBG均顯著升高，且各造模組組間無(wú)差異。與 C組比較，各造模組大鼠膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇均升高。與 M組比較，各治療組大鼠甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、極低

8、密度脂蛋白膽固醇均降低；高密度脂蛋白膽固醇方面，Q組和T組大鼠升高，I組和H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.各組大鼠血清蛋白和腎功能比較:各組間總蛋白（TP）和白蛋白（ALB）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與C組比較，M組大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）和尿酸（UA）均升高；與M組比較，Q組、I組和T組大鼠BUN均降低， H組大鼠無(wú)差異，各治療組大鼠 Scr和 UA均降低。
　　7.腎臟形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
　　7.1光鏡觀察結(jié)果

9、:光鏡下觀察C組腎小球結(jié)構(gòu)清晰。M組腎小球肥大，囊腔變窄，呈裂隙狀，系膜基質(zhì)增生堆積伴基底膜彌漫性增厚，腎小管排列紊亂。與M組比較，各治療組不同程度改善。
　　7.2透射電鏡觀察結(jié)果:透射電鏡下觀察C組腎小球結(jié)構(gòu)相對(duì)正常。M組結(jié)構(gòu)紊亂，基底膜彌漫性增厚，足突出現(xiàn)變寬、扁平、甚至融合消失。與M組比較，各治療組病理改變稍減輕。
　　8.免疫組化檢測(cè)腎皮質(zhì)P-cadherin、TRPC6的表達(dá):光鏡下可觀察到C組P-cadheri

10、n沿腎小球基底膜成線性分布，蛋白表達(dá)量較多；與C組比較，M組表達(dá)量明顯較少；與M組比較，Q組、I組表達(dá)明顯增加，H組和T組無(wú)明顯差異。C組TRPC6表達(dá)微弱；與C組比較，M組TRPC6表達(dá)較強(qiáng)；與M組比較，各治療組不同程度改善；各治療組組間無(wú)明顯差異。
　　9.Real-time PCR檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)P-cadherin和TRPC6 mRNA的表達(dá):與C組比較，M組P-cadherin mRNA水平顯著下調(diào)；與M組比較，Q組和

11、I組P-cadherin mRNA水平明顯上調(diào)，H組和T組則無(wú)明顯上調(diào)；與Q組和I組比較，H組和T組相對(duì)降低。與C組比較，M組大鼠TRPC6 mRNA表達(dá)水平升高；與M組比較，各治療組大鼠TRPC6 mRNA表達(dá)相對(duì)降低；且各治療組組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　10.Western Blot檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)P-cadherin和TRPC6蛋白表達(dá):與C組比較，M組P-cadherin蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)；與M組比較，Q組和I組表達(dá)顯著上

12、調(diào)，且該兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，H組和T組無(wú)明顯上調(diào)；與Q組和I組比較，H組和T組相對(duì)降低。與C組比較，M組TRPC6蛋白表達(dá)量顯著升高；與M組比較，各治療組 TRPC6表達(dá)顯著降低；且各治療組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.高糖高脂飼料聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射法制備的DKD大鼠模型基本成功，先后出現(xiàn)多飲、多食、多尿，逐漸出現(xiàn)蛋白尿，且符合相應(yīng)的病理表現(xiàn)。
　　2.化瘀通絡(luò)中藥能夠改善DKD大鼠一般情況