雞顆粒酶、顆粒溶素的原核表達(dá)及生物學(xué)特性分析.pdf

1、顆粒溶素(Granulysin，GNLY)和顆粒酶（Granzyme，Gzm）都是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocypes，CTLs)和自然殺傷(nature killer, NK)細(xì)胞合成分泌的天然免疫分子。前者在人類具有9和15kD兩種形式，9kD顆粒溶素可直接溶解病原菌和多種寄生原蟲(chóng)及腫瘤細(xì)胞;后者是一類絲氨酸蛋白酶(Serine protease)，可在GNLY和/或穿孔素(perforin)協(xié)同下進(jìn)

2、入被病原體感染的靶細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)caspase非依賴性/依賴性的凋亡機(jī)制而殺死/清除被感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，雞具有編碼GNLY和Gzms的基因。為研究二者在抗球蟲(chóng)天然免疫中的作用，本研究克隆和重組表達(dá)了雞的顆粒溶素及顆粒酶A、K，并對(duì)顆粒溶素的活性分析方法、顆粒酶的酶動(dòng)力學(xué)特征等進(jìn)行了初步研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.PCR克隆得到了ChGzmA和ChGzm K基因的成熟編碼序列，并通過(guò)生物信息

3、軟件對(duì)ChGzmA和ChGzmK序列進(jìn)行了初步分析。測(cè)序結(jié)果顯示克隆的ChGzmA基因長(zhǎng)783 bp，編碼260個(gè)氨基酸，分子量大小約為26 kD;克隆的ChGzmK基因長(zhǎng)789 bp，編碼262個(gè)氨基酸，分子量大小約為27 kD。構(gòu)建了pET26b-ChGzmA和pET26b-ChGzmK原核表達(dá)載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21(DE3)中，經(jīng)由終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后，成功獲得了pET26b-ChGzmA和pE

4、T26b-ChGzmK融合蛋白的可溶性表達(dá)。純化后進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果表明ChGzmA可水解Suc-VANR-pNA，其Km=0.0250±0.00086μM，Vmax=122.96±8.49μM/min/μg;ChGzmK可水解Ac-YRFK-pNA，其Km=0.0083±0.00061μM，Vmax=22.225±5.3832μM/min/μg;ChGzmA和ChGzmK的活性均可被D-Phe-Pro-Arg-CMK抑制，IC50

5、值分別為16.62±1.0629μM和25.464±1.7731μM。
　　2.采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)并以相對(duì)定量法計(jì)算GzmA、GzmK、GzmM和GzmG-like的mRNA在球蟲(chóng)感染后雞盲腸扁桃體中不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄量的差值，并選取雞GAPDH作為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示，未感染球蟲(chóng)組、一次感染球蟲(chóng)組和二次感染球蟲(chóng)組雞盲腸扁桃體中4種顆粒酶的mRNA轉(zhuǎn)錄量沒(méi)有顯著差異。
　　3.用SMART在線工具對(duì)雞顆粒溶素編碼基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)

6、測(cè)，PCR克隆得到了ChGNLY的成熟編碼序列，并通過(guò)生物信息軟件對(duì)ChGNLY序列進(jìn)行了初步分析。測(cè)序結(jié)果顯示克隆的ChGNLY基因長(zhǎng)240 bp，編碼79個(gè)氨基酸，分子量大小約為36 kD。構(gòu)建pGEX-6p-1-ChGNLY原核表達(dá)載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21中，經(jīng)由終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后，成功獲得了ChGNLY融合蛋白的可溶性表達(dá)。純化后利用CellTiter-Glo(@)2.0 Assay檢測(cè)ChG