AMPK在炎癥誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)沉積中的作用.pdf_第1頁(yè)
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1、第一部分炎癥誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)沉積的建立
  目的:臨床研究發(fā)現(xiàn),炎癥可能參與了非酒精性脂肪肝(NAFLD)早期的脂肪沉積過(guò)程,但機(jī)制尚未闡明。因此,在本部分的研究中,我們旨在構(gòu)建炎癥誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)沉積的動(dòng)物與細(xì)胞模型,為進(jìn)一步的機(jī)制研究做準(zhǔn)備。
  方法:①動(dòng)物模型:酪蛋白是近年來(lái)常用的小鼠慢性炎癥刺激因子,因此,我們將6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為炎癥組(Casein, n=7)和對(duì)照組(NC,n=7)。炎癥組隔

2、日皮下注射0.5 ml10%酪蛋白,對(duì)照組注射相應(yīng)劑量的生理鹽水,總時(shí)間為18周。收集小鼠血清,檢測(cè)炎癥因子 MCP-1、TNF-α、IL-6的水平。取小鼠肝臟組織經(jīng)油紅 O染色、TG定量檢測(cè)肝臟組織脂質(zhì)沉積情況, qRT-PCR檢測(cè)肝臟脂代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)。②細(xì)胞模型1:在體內(nèi),Kupffer細(xì)胞是肝臟炎癥的主要來(lái)源細(xì)胞,我們利用 LPS刺激 Kupffer細(xì)胞,檢測(cè)其炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量,并用該

3、上清液干預(yù)HepG2肝細(xì)胞,模擬體內(nèi)Kupffer細(xì)胞與肝細(xì)胞共生長(zhǎng)環(huán)境,后油紅O染色、TG定量檢測(cè)HepG2肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的變化, qRT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞脂代謝關(guān)鍵基因的表達(dá);③細(xì)胞模型2:TNF-α是重要的炎癥因子之一,為了建立更為單純的炎癥干預(yù)的細(xì)胞模型,我們用外源性 TNF-α20ng/mL干預(yù)HepG2細(xì)胞24h后,油紅O染色、TG定量檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況,qRT-PCR以及Western blot方法檢脂質(zhì)合

4、成關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白水平的變化。
  結(jié)果:①動(dòng)物模型:與對(duì)照組相比,酪蛋白注射顯著增加C57BL/6J小鼠血中炎癥因子 MCP-1、TNF-α、IL-6的水平,肝臟脂質(zhì)沉積明顯,脂代謝紊亂。②細(xì)胞模型1:LPS刺激明顯增加Kupffer細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量,上清液干預(yù)HepG2細(xì)胞后,細(xì)胞脂質(zhì)含量顯著增加,脂代謝異常。③細(xì)胞模型2:與對(duì)照組相比,TNF-α促進(jìn) HepG2肝

5、細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積,脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因SREBP1、FAS的表達(dá)明顯升高。
  結(jié)論:成功構(gòu)建炎癥誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)沉積的動(dòng)物與細(xì)胞模型。
  第二部分:AMPK在炎癥誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)沉積中的作用以及可能的機(jī)制
  目的:腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-activated protein kinase, AMPK)是生物體內(nèi)重要的能量感受器,參與脂代謝過(guò)程。在第一部分的研究中,我們已經(jīng)觀察到炎癥誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)沉積。然而,在此過(guò)程中,AM

6、PK通路是否發(fā)揮作用尚不清楚。因此,本部分的研究旨在炎癥誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積模型中,探討AMPK通路的作用以及可能的機(jī)制,為非酒精性脂肪肝的防治提供新的思路。
  方法:①Western blotting檢測(cè)第一部分研究建立的炎癥誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)沉積的動(dòng)物與細(xì)胞模型中 AMPK以及下游 ACC的磷酸化水平以反映AMPK通路激活情況;②探討AMPK通路是否介導(dǎo)了炎癥誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)沉積:在TNF-α誘導(dǎo)的HepG2肝細(xì)胞模型中,加用AMPK激

7、動(dòng)劑二甲雙胍1mM或AICAR1mM,或二甲雙胍1mM聯(lián)合AMPK抑制劑Compound C40μM,干預(yù)24h后,通過(guò)油紅O染色、TG定量檢測(cè)觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況;Western blotting和qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞AMPK/mTOR/SREBP1通路的表達(dá)變化。
  結(jié)果:①與對(duì)照組相比,炎癥小鼠肝臟組織 AMPK以及下游 ACC的磷酸化水平降低; Kupffer細(xì)胞上清液干預(yù)肝細(xì)胞后,肝細(xì)胞 AMPK以及ACC磷酸化明

8、顯減少;在TNF-α作用下,HepG2細(xì)胞AMPK以及ACC磷酸化顯著降低。②在TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型中,加用二甲雙胍或AICAR后,細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著降低,脂質(zhì)沉積得到改善,進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn),AMPK以及ACC磷酸化水平明顯增加,AMPK激活增多, mTORSer2448以及 p70S6K Thr421/Ser424位點(diǎn)的磷酸化水平顯著降低,脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因SREBP1、FAS的表達(dá)顯著減少;而加入二甲雙胍聯(lián)合Compoun

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