高切高脂通過VEGF-VEGFR2信號通路調控血管新生參與動脈粥樣易損斑塊形成.pdf

1、目前的研究和臨床表明，位列全球死亡人數的前兩位的疾病分別為缺血性心臟病和腦血管疾病，高達死亡人數的21.9％。伴隨全國人民生活水平的提高，心腦血管疾病已經躍居為我國的第一位殺手。冠狀動脈粥樣硬化發(fā)病最顯著的特征是冠狀動脈的不穩(wěn)定斑塊破裂，形成血栓堵塞冠狀動脈。因此，對預防冠狀動脈粥樣硬化最重要的手段是早期預判和治療不穩(wěn)定性易損斑塊。冠狀動脈粥樣硬化病理學研究表明，易損斑塊具有以下組織病理學特征:在血管狹窄處容易形成較大的斑塊;斑塊中有薄

2、的纖維帽;炎癥細胞和大的脂核浸潤；斑塊內有較多的新生血管。動脈粥樣硬化易損斑塊內出現(xiàn)的病理性新生血管,能加速粥樣硬化病變的發(fā)展,從而誘發(fā)斑塊破裂脫落，形成血栓堵塞血管，促進其急性心血管事件的發(fā)生。
　　研究報道指出，AS（Atherosclerosis）易損斑塊的形成和破裂的病理原因，一直沒能完全闡述明白，尤其是在高脂和變化的應力場環(huán)境下的趨勢更是無法解釋清楚。而有觀點指出，滋養(yǎng)血管增生以及在斑塊內高密度富集，是其核心關鍵點。此時

3、出現(xiàn)的滋養(yǎng)血管，其功能和結構不完整，尤其外膜的不穩(wěn)定，極易發(fā)生側漏，從而誘發(fā)斑塊內出血和破損出現(xiàn)。因而本文從斑塊內血管新生入手，探索AS易損斑塊形成、發(fā)展的病因；引入高脂環(huán)境和高切應力因素，研究損傷血管在復雜環(huán)境下，斑塊內血管新生與其病變過程之間的關系。
　　VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor）是特異性和作用最強的血管新生因子，參與了多種體內的病理性血管新生，在腫瘤和斑塊血管新生中起著關

4、鍵調控蛋白的作用。在腫瘤血管新生的研究中，已經系統(tǒng)的探索了VEGF及下游通路蛋白在腫瘤病變中的作用機理。然而在AS易損斑塊的研究中，只是證實了VEGF參與了斑塊的病變和血管新生過程，但是對于VEGF影響斑塊血管新生的機理、下游調控蛋白在AS斑塊中的作用、以及與AS易損斑塊的高危因素高脂高切應力之間的關系研究，還無準確的定論?；诖?，本文通過對血管新生經典通路VEGF-VEGFR2-FAK（Focal adhesion kinase）/p

5、axillin在oxLDL（Oxidized low density liporprotein）和高切應力介導的血管新生中的作用研究，明確了VEGF及下游通路蛋白在AS易損斑塊形成中的作用機制，為臨床治療AS貢獻了新的基因靶點。
　　本論文中，我們使用的動物模型為小鼠左頸總動脈套環(huán)模型。在此基礎上給小鼠飼喂高脂飼料（1%膽固醇和5%豬油），進而研究斑塊的組成、血管新生數量。通過血管新生抑制劑（TNP-470）對模型組注射治療，研究

6、治療組斑塊的形成和血管新生情況。從動物模型上，證明血管新生能促進動脈粥樣硬化易損斑塊的形成。在正常組和模型組血管中分別對血管新生相關基因VEGF、CD31（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1）進行免疫染色，發(fā)現(xiàn)模型組中VEGF和CD31表達都集中在斑塊的肩部和纖維帽區(qū)域（較正常組）。并通過合成VEGFsiRNA、VEGFR1siRNA、VEGFR2siRNA、VEGF重組蛋白對高脂

7、高切應力影響下的內皮細胞刺激，觀察下游通路蛋白FAK/paxillin的活化（磷酸化），以及對內皮細胞遷移和管腔形成的影響，來探索高脂高切應力介導下的斑塊血管新生的信號傳導途徑。
　　主要研究內容和結果如下：
　?、贅嫿ㄐ∈笞箢i動脈套環(huán)模型，右側頸動脈進行假手術對照。單一套環(huán)模型只能刺激內膜增生，不誘導易損斑塊的形成。其中增生的體積在高低切應力區(qū)域基本一致。加入高脂因素，左頸動脈高切應力區(qū)域（狹窄近心端）出現(xiàn)大量不穩(wěn)定斑塊，

8、低切應力區(qū)域（遠心端）無斑塊形成，僅有一定內膜增生。而正常組血管，在高脂環(huán)境下，其血管壁有少量脂肪顆粒沉積和內膜增生。通過HE染色，顯示高切應力區(qū)域易損斑塊內的新生血管主要為外膜不完整、內皮細胞有凋亡趨勢、管腔內有大量淋巴細胞浸潤的易泄漏微血管。而TNP-470治療組，血管內膜增生減弱，易損斑塊中的血管新生有所減弱,斑塊面積減少。
　?、谕ㄟ^對小鼠頸動脈進行血管新生相關蛋白VEGF、CD31免疫染色。發(fā)現(xiàn)在正常組中，血管無VEGF

9、、CD31的陽性表達。而模型組高切應力組中，VEGF、CD31在斑塊的肩部和纖維帽區(qū)域都存在陽性高表達。研究顯示，VEGF參與了斑塊血管新生的病理過程，從而為我們選擇VEGF作為關于血管新生的研究靶點提供了依據。
　?、弁ㄟ^用oxLDL和切應力分別刺激HUVECs（Human umbilical vascular endothelial cell）,研究兩者對HUVECs遷移和管腔形成的影響。發(fā)現(xiàn)正常組內皮細胞無遷移和管腔形成。而

10、oxLDL組內皮細胞遷移和管腔形成明顯，其中最佳濃度為20μg/mL。高切應力組內皮細胞遷移和管腔形成明顯，最佳壓力為25dyn/cm2。研究顯示，oxLDL和高切應力能促進內皮細胞功能主導的血管新生。
　?、芡ㄟ^合成VEGFsiRNA、VEGF重組蛋白對高脂高切應力影響下的內皮細胞刺激，研究VEGF在oxLDL和高切應力介導的血管新生中的作用。實驗結果表明，VEGF的過表達，能促進HUVECs遷移和管腔形成；同時高脂高切應力都能

11、促進HUVECs中VEGF及下游受體（VEGFR1、VEGFR2）的過表達；VEGFsiRNA組內皮細胞用oxLDL和高切應力刺激，內皮細胞的遷移和管腔形成明顯減少（較oxLDL和高切應力組）。研究顯示，VEGF是oxLDL和高切應力調控血管新生的關鍵蛋白。
　?、萃ㄟ^合成VEGFR1siRNA、VEGFR2siRNA、VEGF重組蛋白、VEGFsiRNA對高脂高切應力影響下的內皮細胞刺激，研究VEGF-VEGFR2-FAK/pa

12、xillin信號通路在oxLDL和高切應力介導的血管新生中的作用。實驗結果說明，VEGF能調控VEGFR2下游蛋白FAK/paxillin的磷酸化；oxLDL和高切應力通過VEGF調控VEGFR2-FAK/paxillin下游信號通路的表達；同時VEGFR2能調控下游蛋白FAK/paxillin的磷酸化;VEGFR2/VEGFR1是VEGF調控血管新生的關鍵因子。因此，在高脂高切應力調控的血管新生中，VEGF-VEGFR2-FAK/pa