IL-17與LPS協(xié)同介導(dǎo)炎性腸病的效應(yīng)機制研究.pdf

1、目的:
　　 Th17細胞及其細胞因子IL-17在自身免疫性炎性腸病的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其具體的效應(yīng)機制尚不十分清楚。在炎癥環(huán)境中，IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)常與其它炎癥介質(zhì)（如細菌脂多糖，LPS）引發(fā)的反應(yīng)伴隨存在，因此有必要探討IL-17與其它炎癥介質(zhì)聯(lián)合作用。IL-17的效應(yīng)機制如何，通過什么樣的機制與其它的炎癥介質(zhì)發(fā)揮聯(lián)合作用是目前尚不清楚的課題?；谏鲜霰尘?，我們首先探討IL-17細胞因子在TNBS誘導(dǎo)的炎性腸病

2、動物模型中的表達變化;其次以HT-29結(jié)腸癌上皮細胞系為模型，研究IL-17與脂多糖(LPS)在結(jié)腸上皮細胞中的效應(yīng)機制，為以IL-17為靶點的炎性腸病干預(yù)策略提供新的理論及實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一:探討IL-17/IL-17R在炎性腸病中的表達變化。通過建立TNBS炎性腸病模型，采用嗜熱菌蛋白酶分離法，進行小鼠結(jié)直腸上皮細胞的分離，提取腸上皮細胞總RNA，通過Real-time PCR方法檢測IL-17及其

3、受體在TNBS炎性腸病模型中的表達變化;
　　 第二:以人腸上皮細胞---HT-29細胞為模型，觀察IL-17與細菌脂多糖LPS協(xié)同促進腸上皮細胞活化，介導(dǎo)免疫損傷的分子機制。
　　 首先通過流式細胞儀分離技術(shù)(FACS)檢測IL-17RA、TLR-4在HT-29細胞中的表達，在此基礎(chǔ)上觀察IL-17和不同劑量LPS干預(yù)人腸上皮細胞（HT-29細胞）;以及為探討IL-17與不同濃度LPS共同在HT-29細胞中的效應(yīng)，通過

4、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法，檢測細胞因子IL-8的表達;其次為探討IL-17協(xié)同LPS促進HT-29細胞活化的信號傳導(dǎo)機制，我們通過Western Blot技術(shù)，觀察IL-17與LPS聯(lián)合干預(yù)人腸上皮細胞(HT-29細胞)后細胞內(nèi)PI3K-AKT、NF-κ B、MAPK通路的活化情況;再次在IL-17協(xié)同LPS通過PI3K-AKT、NF-κ B、MAPK通路促進HT-29細胞活化基礎(chǔ)上，為探討在自身免疫性炎性腸病發(fā)病過程中多種因子共

5、同作用、相互影響體內(nèi)微環(huán)境情況下細胞因子及趨化因子可能的效應(yīng).我們通過體外實驗，利用Real-time PCR方法來觀察hIL-17和LPS聯(lián)合作用于HT-29細胞情況下中性粒細胞、Th17細胞、Th1細胞等趨化因子的變化;最后為進一步明確介導(dǎo)hIL-17和LPS在基因水平效應(yīng)的具體細胞內(nèi)信號機制，我們通過給予各信號通路抑制劑干預(yù)情況下，利用Real-time PCR方法觀察hIL-17和LPS聯(lián)合作用于HT-29細胞后趨化因子的變化。

6、
　　 結(jié)果:
　　 第一:IL-17以及IL-17RAmRNA在TNBS誘導(dǎo)的炎性腸病動物模型中表達顯著升高(P＜0.03);
　　 第二:在以HT-29結(jié)腸上皮細胞模型中，首先我們實驗發(fā)現(xiàn)HT-29細胞高表達IL-17RA，以及TLR4分子，在此基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)靜息狀態(tài)下HT-29細胞表達IL-8的水平低，LPS刺激(10 ng/mL)6h后腸上皮細胞開始表達IL-8，第12 h時IL-8的表達顯著增加(與第6

7、h時相比，P＜0.01)，第24h達高峰(與第12 h時相比，P＜0.01)，而IL-17單獨作用于HT-29細胞表達IL-8的水平低;其次我們研究發(fā)現(xiàn)IL-17能與低濃度的LPS協(xié)同促進IL-8的表達(2187.61±132.42 vs2634.27±134.63，P=0.01)，但隨著LPS劑量升高，LPS本身誘導(dǎo)IL-8表達的活性降低，且與IL-17的協(xié)同作用消失(1841.43±50.38 vs1685.67±71.47，P=0

8、.01);研究IL-17與低濃度LPS聯(lián)合作用的細胞內(nèi)信號機制，發(fā)現(xiàn)是通過增強NF-κ B、PI3K-AKT、MAPK信號通路的活化，促進炎癥反應(yīng).再次，我們研究IL-17和LPS作用于HT-29細胞情況下趨化因子的變化，發(fā)現(xiàn)IL-17單獨效應(yīng)弱，兩者協(xié)同促進中性粒相關(guān)趨化因子(包括CXCL-1、CXCL-2，CXCL-5，CXCL-6，CXCL-8)和Th17細胞趨化因子CCL-20mRNA的表達;最后我們探討介導(dǎo)其趨化因子變化的具體

9、細胞內(nèi)信號機制，發(fā)現(xiàn)中性粒相關(guān)趨化因子表達是通過NF-κ B、PI3k、MAPK途徑介導(dǎo)的，只是不同通路作用的程度不同;對于Th17細胞趨化因子的表達是通過NF-κB、MAPK途徑介導(dǎo)活化的，而PI3k通路介導(dǎo)抑制;IL-17拮抗LPS誘導(dǎo)的Th1細胞因子的表達，是由PI3k、ERK介導(dǎo)的，而NF-κ B、P38起相反作用。
　　 結(jié)論:
　　 ①IL-17參與炎性腸病的免疫損傷過程。
　　 ②IL-17與低濃度