綿羊精原干細(xì)胞非分化擴(kuò)增的影響因素研究.pdf

1、目的：探討精原干細(xì)胞體外分離和非分化擴(kuò)增的影響因素,為研究精原干細(xì)胞體內(nèi)外生存條件及長(zhǎng)期培養(yǎng)、定向分化和轉(zhuǎn)基因奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：本研究中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用2-5月齡綿羊公羔,取其睪丸以2步酶消化法、Percoll不連續(xù)密度梯度離心法、差速貼壁法分離純化綿羊精原干細(xì)胞,分別以添加0％、2.5％、5％、10％胎牛血清的DMEM/F12或DMEM為基本培養(yǎng)液,以2×105細(xì)胞/cm2的密度接種于睪丸支持細(xì)胞或綿羊胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上

2、,分別置于33℃、35℃、37℃,飽和濕度,5％CO2濃度條件下培養(yǎng),每星期換液2次。每間隔一定時(shí)間,置倒置顯微鏡下觀察,或進(jìn)行堿性磷酸酶(AP)組化染色檢測(cè)、鑒定精原細(xì)胞。 結(jié)果： 1、Percoll不連續(xù)密度梯度離心和差速貼壁等方法可以有效的分離純化綿羊精原細(xì)胞,其中精原細(xì)胞主要分布于密度梯度為27％～35％(密度1.0410g/ml～1.0508g/ml)的帶間,純度可達(dá)56.7％。 2、37℃條件下培養(yǎng)S

3、SCs不但能有效減少培養(yǎng)體系中的已分化精原細(xì)胞,還能促進(jìn)干細(xì)胞的增殖。而在實(shí)驗(yàn)中,35℃條件下的細(xì)胞存活時(shí)間較長(zhǎng),增殖數(shù)量較多,35℃、37℃都是體外培養(yǎng)綿羊精原干細(xì)胞的較理想溫度。 3、在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)一個(gè)星期,只有20％的細(xì)胞存活,然而在添加2.5％的FCS中,有大約80％的細(xì)胞存活并增殖,當(dāng)血清濃度超過(guò)2.5％時(shí),精原干細(xì)胞的比率下降,高濃度的FCS只是提高單個(gè)細(xì)胞的數(shù)目。 4、在DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)

4、基中的細(xì)胞活力和增殖能力無(wú)明顯差別。 5、兩種飼養(yǎng)層上的精原干細(xì)胞早期(1周內(nèi))的生物學(xué)行為非常相似,但培養(yǎng)1周后,Sertoli細(xì)胞作飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中保留的精原干細(xì)胞要比SFFCs明顯增多,約有30％的SSCs能存活下來(lái)并能維持存活到60d左右。Sertoli細(xì)胞作為綿羊精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的飼養(yǎng)層不但能促進(jìn)其存活增殖,還是一種簡(jiǎn)單快捷的培養(yǎng)方法。 結(jié)論： 1、Percoll不連續(xù)密度梯度離心和差速貼壁等方法可

5、以有效的對(duì)綿羊精原細(xì)胞進(jìn)行分離純化,兩種方法結(jié)合分離和純化效果明顯提高。 2.35℃、37℃都可以作為體外培養(yǎng)綿羊精原干細(xì)胞的溫度。 3.DMEM和DMEM/F12都適合做綿羊精原干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在培養(yǎng)液中添加2.5％的胎牛清可促進(jìn)綿羊精原干細(xì)胞的增殖，為綿羊精原干細(xì)胞本外培養(yǎng)最適血清濃度。 4、在不添加外源生長(zhǎng)因子的情況下,飼養(yǎng)層對(duì)綿羊精原干細(xì)胞的存活、增殖是必須的,Sertoli細(xì)胞作為綿羊精原干細(xì)胞體外