miR-214及CREB1在胃癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是我國(guó)及世界上最常見的惡性腫瘤之一，胃癌患者的預(yù)后較差。浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是胃癌的一個(gè)重要特征，常導(dǎo)致患者預(yù)后不良。揭示胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是胃癌基礎(chǔ)和臨床研究的重要課題。
　　除了基因?qū)W的改變以外，非編碼RNA特別是microRNA(miRNA，miR)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA是一類內(nèi)生性的、長(zhǎng)度約19-25個(gè)核苷酸的小RNA，主要是通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合，降解靶

2、mRNA或抑制靶蛋白的翻譯，廣泛參與增殖、凋亡、發(fā)育、分化等多種生物學(xué)過程，在人類疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。而目前尚未見miR-214在胃癌中的詳細(xì)研究。
　　本研究擬在人胃癌組織及細(xì)胞系中檢測(cè)miR-214的表達(dá)情況，進(jìn)行miR-214功能學(xué)實(shí)驗(yàn)以探究其生物學(xué)作用，并鑒定其調(diào)控的靶基因。預(yù)測(cè)軟件提示cAMPresponsive element binding protein1（CREB1，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）

3、可能是miR-214的一個(gè)靶基因，本課題擬初步探究CREB1在胃癌中的表達(dá)、功能及分子機(jī)制，以期為胃癌的診斷和治療提供新的方法和靶點(diǎn)。
　　第一部分胃癌中miR-214表達(dá)的臨床意義及其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　研究目的:
　　1.檢測(cè)miR-214在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　2.分析miR-214與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。
　　3.探究miR-214對(duì)胃癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及增殖、凋亡的影響

4、。
　　4.鑒定miR-214直接調(diào)控的靶基因。
　　研究方法:
　　1.使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)80例胃癌組織和18例非腫瘤胃黏膜組織及4種胃癌細(xì)胞株（MKN28、BGC823、MKN45及SGC7901）、1種非腫瘤的永生化細(xì)胞株GES-1中miR-214的表達(dá)情況。
　　2.收集患者臨床資料及隨訪信息，分析miR-214與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Kaplan-Meier法及Log-rank檢

5、驗(yàn)分析miR-214的預(yù)后價(jià)值。
　　3.胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV3-hsa-miR-214（過表達(dá)）、miR-214 inhibitor（抑制劑）及Negative control（陰性對(duì)照）后，進(jìn)行細(xì)胞遷移浸潤(rùn)和增殖、凋亡實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其生物學(xué)功能。
　　4.使用TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-214的靶基因，通過熒光素酶檢測(cè)和Western blot實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-214調(diào)控的直接靶基因。
　　結(jié)果:
　　1.8

6、0例胃癌組織中miR-214的表達(dá)水平較18例非腫瘤胃黏膜組織下調(diào)約6倍，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中下調(diào)更明顯。同時(shí)，4種胃癌細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平較非腫瘤胃粘膜組織也呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)。
　　2.miR-214的表達(dá)與腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。然而生存分析顯示miR-214對(duì)患者的預(yù)后無明顯影響。
　　3.miR-214可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤(rùn)能力，而對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯作用。
　　4.靶基因軟件Tar

7、getScan預(yù)測(cè)提示FGFR1、CSF1、NOTCH2、CREB1、AGAP2等是miR-214的潛在靶基因。熒光素酶實(shí)驗(yàn)和Western blot證實(shí)CSF1是miR-214的直接靶基因。
　　結(jié)論及意義:
　　miR-214在胃癌組織和多種胃癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，在轉(zhuǎn)移性的胃癌組織中降低更明顯。miR-214可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤(rùn)能力，而對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯影響。CSF1是miR-214的直接靶基因。miR-214對(duì)

8、其它靶基因（如CREB1等）的調(diào)控作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。miR-214可下調(diào)CSF1的表達(dá)，miR-214可能通過調(diào)控CSF1發(fā)揮了抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移浸潤(rùn)的作用。
　　第二部分胃癌中CREB1的表達(dá)、預(yù)后價(jià)值及miRNA對(duì)其的調(diào)控作用
　　研究目的:
　　1.檢測(cè)CREB1在胃癌組織中的表達(dá)情況。
　　2.分析CREB1在胃癌中的臨床意義及預(yù)后價(jià)值。
　　3.驗(yàn)證CREB1是否受到miR-214等miRN

9、A的調(diào)節(jié)。
　　研究方法:
　　1.免疫組化檢測(cè)185例原發(fā)灶胃癌組織、50例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶胃癌組織、50例非腫瘤胃粘膜組織中CREB1蛋白的表達(dá)情況。
　　2.使用卡方檢驗(yàn)分析CREB1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)分析CREB1表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系。
　　3.使用miRWalk、starBase軟件預(yù)測(cè)可能調(diào)控CREB1的miRNA，通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)、Western

10、blot驗(yàn)證miRNA對(duì)CREB1的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.CREB1在非腫瘤胃粘膜組織、胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中呈遞增式表達(dá)。CREB1表達(dá)水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織相比于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中明顯升高。
　　2.CREB1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期正相關(guān)。
　　3.CREB1高表達(dá)的患者的總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間明顯短于CREB1低表達(dá)的患者。CREB1與腫瘤分期聯(lián)合構(gòu)建的模型，是一個(gè)獨(dú)立

11、的預(yù)后因子。
　　4.CREB1是miR-27b和miR-200b的直接靶基因，受到miR-27b和miR-200b的負(fù)向調(diào)控。
　　結(jié)論及意義:
　　CREB1的高表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和患者預(yù)后不良相關(guān)。miR-27b和miR-200b可負(fù)向調(diào)節(jié)CREB1的表達(dá)。CREB1是一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)記物，對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病人預(yù)后有重要提示作用。miR-27b/200b-CREB1信號(hào)通路可能為胃癌的治療提供新的

12、靶點(diǎn)。
　　第三部分 CREB1在胃癌中的功能及作用機(jī)制初探
　　研究目的:
　　1.探究CREB1在胃癌中的生物學(xué)功能。
　　2.鑒定轉(zhuǎn)錄因子CREB1的下游靶基因，初步探討CREB1的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)CREB1或干擾CREB1的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移浸潤(rùn)能力的影響。
　　2.在胃癌細(xì)胞中，利用染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序(Chromatin immunop

13、recipitationsequencing，ChIP-seq)分析轉(zhuǎn)錄因子CREB1在全基因組的結(jié)合譜，篩選CREB1可能調(diào)控的mRNA、miRNA、lncRNA。
　　3.在細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREB1過表達(dá)質(zhì)?；駽REB1干擾RNA之后，使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CREB1下游候選lncRNA的表達(dá)水平。
　　4.使用ChIP-qPCR（染色質(zhì)免疫共沉淀-實(shí)時(shí)定量PCR）證實(shí)CREB1與lncRNA啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　結(jié)果:<

14、br>　　1.過表達(dá)CREB1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤(rùn);反之，下調(diào)CREB1表達(dá)則抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤(rùn)。
　　2.ChIP-seq結(jié)果提示CREB1可以結(jié)合到831個(gè)mRNA、276個(gè)lncRNA、62個(gè)miRNA的啟動(dòng)子區(qū)。
　　3.ChIP-seq的結(jié)果與本課題組前期做的胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)lncRNA芯片取交集，將候選lncRNA范圍縮減為9個(gè)。
　　4.通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CREB1可正向調(diào)節(jié)l