二肽基肽酶-4抑制劑在慢性壓力誘導下對造血干細胞的影響.pdf

1、背景:二肽基肽-4(DPP4)抑制劑可以保護心血管系統(tǒng)。有研究表明，造血干細胞(HSC)的激活與慢性壓力對腦和心血管疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。根據(jù)心理情志和免疫系統(tǒng)之間的相互作用，為探究壓力和疾病的發(fā)生和發(fā)展提供了內(nèi)在聯(lián)系，以及壓力致病機理提供了研究方向，我們運用慢性應激模型，聚焦于論證慢性壓力激活造血干細胞(HSC)，進而引起一系列的過激免疫應激反應而危害心腦血管系統(tǒng)。DPP4抑制劑，通過GLP1/GLP1R介導的Adrβ3/Cxcl12

2、信號通路，可以改善BM中HSC的過度活化。
　　目的:基于心理情志和免疫系統(tǒng)之間的潛在聯(lián)系，為連接慢性應激和疾病的發(fā)生和發(fā)展奠定了基石，我們聚焦于DPP-4抑制劑，尋求DPP4抑制劑改善慢性應激的不良反應的理論依據(jù)——即，DPP-4抑制劑是通過對ADRβ3/CXCL12依賴介導的GLP-1/GLP-1R軸的抑制，而抑制骨髓造血干細胞(HSC)的活化，從而減輕外周血炎癥因子的聚集引起的炎癥反應。
　　材料與方法:實驗使用8周齡

3、的雄性小鼠（C57BL/6J，體重21-25g）隨機分組進行慢性應激實驗（2小時兩次/天;7天/周）正常飲食，給予慢性壓力的小鼠又隨機分成3組，不給藥組和給予DPP4抑制劑的低劑量或高的劑量（10或30毫克/kg/2次/日）。此外，對于應激實驗中的小鼠投與艾塞那肽（10微克/kg/2次/日）。未接受慢性應激的小鼠作為對照。實驗還使用了DPP4基因敲除的大鼠(DuCrj)和對照組(F344/JCL)，并對其隨機分組，一組未接受慢性應激作為

4、對照組，一組進行慢性應激實驗（2小時兩次/天;7天/周）正常飲食。壓力實驗過程中記錄了體重(BW)，收縮壓(SBP)，舒張壓(DBP)，和心率(HR)，并測了血漿中的葡萄糖，尿素氮，非酯化脂肪酸(NEFA)，肌酐，高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)，血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)，甘油三酯(TG)，總膽固醇(TCH)，多巴胺(DA)，去甲腎上腺素(NA)和腎上腺素(A)。用ELISA評價血漿水平基質(zhì)衍生afactor-1(SD

5、F-1)和胰高血糖素樣蛋白-1(GLP-1)。檢測外周血的白血細胞(WBC)，紅細胞(RWC)，血小板，血紅蛋白(Hb)的，平均紅細胞血紅蛋白(MCV)，平均紅細胞體積(MCH)，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞和單核細胞。小鼠和大鼠骨髓切片進行了H&E染色和免疫染色(包括BrdU，Ki67+/Sca-1+，Ki67+/c-kit+)。使用DPPIV-GloTM蛋白酶分析試劑盒測血液以及組織（包括腦，肌肉，肝，腸，腎，內(nèi)臟脂肪，主動脈，肺和心

6、臟）中DPP4的蛋白活性。流式細胞儀(FACS)分析以評價小鼠骨髓:c-kit+/Sca-1+，CD48-/CD150+s等造血干細胞的指標，以及細胞周期分析細胞周期（G0-G1期，S期，G2期，M期）;評價小鼠末梢血:CD45+高表達白細胞，中性粒細胞，Ly6C高表達單核細胞，Ly6C陰性的巨噬細胞，CD4+/ CD8+高表達T淋巴細胞等，運用明膠酶譜法施檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2和9的活性。免疫組織化學染色/免疫熒光染色、免疫蛋白印跡(W

7、esternBlot)多種檢測方法揭示DPP-4的抑制劑可以調(diào)控慢性壓力誘導激活的HSC的增殖。
　　結(jié)果:與對照組相比，小鼠慢性壓力后皮下脂肪和腹股溝脂肪減少甚至消失，壓力組小鼠體重明顯降低，腎上腺素和去甲腎上腺素，而血漿甘油三酯也明顯降低了，而SBP以及血漿NEFA明顯增加。然而，血漿中LDL，HDL，葡萄糖，AST，BUN和肌酸的水平，在對照組和壓力組之間沒有存在統(tǒng)計學意義上的差異。
　　1.慢性壓力可以增加血漿和各組

8、織中的DPP4活性。使用DPPIV-GloTM蛋白酶分析試劑盒，檢測對照組和慢性應激組的血液和組織（包括腦，肌肉，肝，脾，小腸，皮下脂肪，內(nèi)臟脂肪，腎，肺和心臟）中DPP4活性。我們觀察到對照組小鼠（腦，心臟，肺，脾，小腸，皮下脂肪，內(nèi)臟脂肪，腎和肝）的組織中以及血液中的DPP4活性處于低水平。而壓力組與預期結(jié)果一致，進行4w慢性壓力后，血液和其他組織（除了肝組織以外，腦，腎，肌肉等）DPP4的活性顯著增加;在DPP4活性變化中，變化最

9、高的表現(xiàn)為大腦——（小鼠大腦中DPP4活性與對照組相比增加了10倍;大鼠大腦中DPP4活性與對照組相比增加了20倍），這就表明受壓后極有可能由大腦首先接受壓力刺激或?qū)毫Υ碳そ邮茏顬槊舾校鳧PP4可以通過血腦屏障，自然成為了如實反應壓力刺激的擔當。對大腦的石蠟切片進行H&E染色，顯示其結(jié)構(gòu)圖（增刊圖S2a中）。使用CD26抗體(CD26是DPP4其中一個別名)的免疫染色顯示，我們觀察到慢性應激導致在大腦中CD26陽性表現(xiàn)的增強。我們對

10、實驗對照組和壓力組的DPP4活性進行定時監(jiān)測——即，分別在壓力實施后1w，2w，3w，4w測定兩組大鼠血液中的DPP4活性，在血液中DPP4的活性隨著壓力時間的增加而增加，這表明增加的DPP4活性與壓力存在正相關(guān)的關(guān)系。此外，血漿中GLP-1和SDF-1的水平與對照小鼠相比壓力組小鼠的顯著降低。
　　2.慢性應激活化炎癥細胞和HSC的增殖。探索壓力與白細胞增高的關(guān)系以及促使其增高后的不良影響。對實驗小鼠進行4周應激，運用小動物末梢

11、血檢測儀檢測其末梢血。與對照組相比，壓力組小鼠血液中白細胞，中性粒細胞和單核細胞明顯增加，這與以前的臨床自然醫(yī)學雜志的研究報道相吻合。接下來我們通過流式細胞儀(FACS)測定這些炎癥細胞（中性粒細胞，單核細胞和巨噬細胞）在骨髓中亦顯著增多。另外，我們通過FACS也對慢性應激對造血干細胞的增殖和細胞周期的影響進行了研究。細胞周期包括G0-G1期，S期，G2期，M期四個期。G1期，指從有絲分裂完成到期DNA復制之前的間隙時間;S期(synt

12、hesis phase)，指DNA復制的時期;G2期，指DNA復制完成到有絲分裂開始之前的一段時間;M期又稱D期(mitosis or division)，細胞分裂開始到結(jié)束。S/M/G2屬于細胞增殖期，應激組小鼠骨髓細胞S/M/G2期百分比明顯增高，說明應激后細胞處于增殖期。造血干細胞的指標Lin-c-kit+/Sca-1+，
　　CD48+/CD150+的增多，表明造血干細胞的增多。骨髓石蠟切片使用H&E常規(guī)染色和BrdU免疫

13、組織化學染色，壓力組小鼠的BrdU陽性細胞明顯增加。收集4周應激小鼠和對照組的BM細胞進行細胞培養(yǎng)。4天后分別進行Sca-1+/Ki67+ PCNA+/ CD150+雙重免疫熒光染色，雙陽性細胞明顯增加。表明壓力誘導BM中的HSC的增殖。探索應激誘導HSC增殖的細胞機制，我們收集實驗小鼠的大腦和BM蛋白和RNA樣本，應用Western和RT-PCR檢測GLP-1受體(GLP-1R)和Adrβ3蛋白質(zhì)的表達以及CXCL12的基因表達。壓力

14、小鼠腦中的GLP-1R蛋白的表達和CXCL12基因表達明顯降低;而骨髓細胞的Adrβ3蛋白的表達顯著增加。運用Gelatinzymography（基質(zhì)金屬蛋白酶活性的代表性檢測分析法明膠酶譜頻），定量分析顯示，壓力組BM細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的活性明顯增加。最近各別研究表明在慢性受壓后交感神經(jīng)的活化和BM的CXCL12的抑制之間存在密切聯(lián)系。與這些研究報道相符合的是，我們檢測的血漿中GLP-1和SDF-1的水平，壓力小鼠比對

15、照小鼠相比顯著降低。因此，壓力狀態(tài)下，白細胞的增多極有可能通過GLP1/GLP1R介導的Adrβ3/Cxcl12信號通路，與BM中HSC活化聯(lián)接起來。
　　結(jié)論:
　　DPP4活性于應激下血循環(huán)和大腦中增高，提倡無創(chuàng)傷性檢測血液中的DPP4活性，可以作為應激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種特異性新型的生物標記物。此外，我們探明了DPP4通過GLP-1/GLP-1R介導的Adrβ3/CXCL12信號通路調(diào)控的造血干細胞的增殖活性。從而，提出了