DACT1對髓系白血病細胞生物學行為的影響及相關機制的研究.pdf

1、目的：白血病是起源于造血干/祖細胞的一組惡性疾病，在發(fā)病機制以及臨床表現(xiàn)方面具有較大的異質性，近年來，該病的發(fā)病率有逐年增高的趨勢。目前，白血病在診斷及治療方面取得了較大的進展，以化療為基礎的綜合性治療，尤其是異基因造血干細胞移植技術的發(fā)展大大的改善了患者的生存。對白血病發(fā)病機制的深入研究推動了該病的診治進展，慢性粒細胞白血病及急性早幼粒細胞白血病患者受益于靶向藥物的出現(xiàn)，可以長期無病生存。但是除上述兩種類型外，其他類型白血病的治療效果

2、仍不能令人滿意。因此，對白血病發(fā)病機制的深入探討有助于全面了解白血病的發(fā)生及發(fā)展，并為白血病的靶向治療提供潛在的可能。DACT1是DAPPER家族成員之一，可以通過降解Wnt通路的關鍵因子散亂蛋白調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路。研究證實DACT1在肝癌、乳腺癌及胃癌等腫瘤細胞中具有抑癌基因的作用，但在結腸癌中發(fā)揮癌基因的作用。DACT1在髓系白血病細胞中的表達情況及作用尚不明確，其對白血病細胞的增殖及凋亡起到何種作用，作用途

3、徑與其在實體腫瘤中有無異同，都是我們需要探討及解決的問題。為了揭示DACT1在髓系白血病中的作用及機制，我們進行了一系列研究，希望能為白血病的診治提供新的思路。
　　方法：采集急性髓系白血病患者骨髓液，通過密度梯度離心法提取單個核細胞，應用實時熒光定量PCR法測定樣本DACT1的mRNA表達情況，并以非惡性血液病患者骨髓標本為正常對照。同時以髓系白血病細胞系K562、HL60、KG1α、THP-1及NB4為研究對象，檢測DACT1

4、 mRNA的表達;篩選出低表達DACT1的K562及KG1α細胞應用Attractene Transfection Reagent轉染試劑進行瞬時轉染，通過實時熒光定量PCR和western blot法驗證轉染效果;采用免疫熒光法檢測DACT1在細胞中的表達及亞細胞定位;利用CCK-8法檢測DACT1對K562及KG1α細胞增殖活性的影響;采用克隆形成實驗檢測過表達DACT1對K562及KG1α細胞克隆形成能力的影響;應用Annexin

5、Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率;應用流式細胞術檢測過表達DACT1對K562及KG1α細胞周期分布的影響;為了探討過表達DACT1對凋亡相關蛋白的影響，我們應用western blot方法檢測Bcl-2，Bax，Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達情況;為了探討DACT1作用于髓系白血病細胞的具體機制，我們應用實時熒光定量PCR法測定Wnt通路關鍵因子β-catenin的mRNA表達;應用免疫熒光法檢測β-c

6、atenin蛋白的亞細胞定位;采用western blot法檢測Wnt通路靶蛋白的表達。我們進一步利用CCK-8法檢測過表達DACT1對白血病細胞化療敏感性的影響;應用western blot法檢測過表達DACT1對多藥耐藥蛋白BCRP及P-gp的影響;為了研究DACT1是否影響藥物外排，應用流式細胞術檢測過表達DACT1對KG1α細胞中羅丹明濃度的影響。
　　結果：⑴DACT1在急性髓系白血病患者中的mRNA表達水平明顯低于非惡

7、性血液病者。應用實時熒光定量PCR方法檢測髓系白血病細胞系K562、HL60、KG1α、THP-1及NB4細胞DACT1mRNA的表達，可見DACT1在髓系白血病細胞中普遍存在低表達。轉染DACT1質?；蚩蛰d質粒vector進入K562及KG1α細胞，應用實時熒光定量PCR和western blot法證實了轉染后DACT1在K562及KG1α細胞中的表達上調(diào)。免疫熒光結果顯示DACT1主要表達于細胞漿中，轉染后可以增加DACT1在細胞漿

8、中的表達。應用CCK-8法檢測DACT1對K562及KG1α細胞增殖活性的影響，與K562及K562/vector相比，K562/DACT1細胞增殖速度明顯減慢;與KG1α及KG1α/vector相比，KG1α/DACT1細胞增殖速度明顯減慢。DACT1過表達可以抑制K562及KG1α細胞的增殖活性?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示過表達DACT1能明顯抑制細胞的克隆形成能力，差異具有統(tǒng)計學意義;轉染48h后應用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染

9、流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果顯示過表達DACT1可以誘導K562和KG1α細胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學意義;采用流式細胞術檢測過表達DACT1對K562及KG1α細胞周期分布的影響，結果可見G0/G1期細胞比例較對照組明顯增高，而S期及G2/M期比例降低，，過表達DACT1使K562及KG1α細胞更多的停滯于G0/G1期，差異具有統(tǒng)計學意義。為了檢測過表達DACT1對凋亡相關蛋白的影響，我們應用western blot方法檢測Bcl-2，

10、Bax，Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達情況。結果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，過表達DACT1可以使促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)。⑵利用實時熒光定量PCR法檢測過表達DACT1后Wnt/β-catenin通路中關鍵因子β-catenin的mRNA表達，結果顯示，DACT1過表達可以使KG1α細胞中β-catenin的mRNA表達下調(diào);采用間接免疫熒

11、光法檢測DACT1過表達是否對β-catenin蛋白的亞細胞定位產(chǎn)生影響，結果顯示，DACT1過表達組細胞核中的熒光強度明顯低于對照組，表明過表達DACT1可能影響了β-catenin在胞漿及胞核中的分布比例，使其在胞核中的量減少;利用western blot方法檢測cyclinD1、C-myc及IL-8蛋白的表達，結果顯示，與對照組相比，DACT1過表達組cyclinD1、C-myc及IL-8蛋白的表達明顯下調(diào)。⑶利用CCK8法檢測過

12、表達DACT1對柔紅霉素的化療敏感性，柔紅霉素終濃度為1ug/ml，孵育24h、48h、72h后進行CCK8檢測。結果顯示，過表達DACT1可增加KG1α細胞對柔紅霉素的細胞毒作用;利用western blot法檢測多藥耐藥蛋白的表達，結果顯示，與陰性對照組及空白對照組相比，過表達DACT1組多藥耐藥蛋白BCRP、P-gp的表達下調(diào)。利用流式細胞術檢測過表達DACT1組、空載體轉染組及空白對照組羅丹明的平均熒光強度，結果顯示，DACT1

13、過表達組KG1α細胞內(nèi)羅丹明的平均熒光強度明顯增加，表明過表達DACT1后細胞內(nèi)藥物濃度明顯增加。
　　結論：①同正常對照相比，DACT1在急性髓系白血病患者和白血病細胞系中的表達明顯下調(diào)。②過表達DACT1可以抑制白血病細胞的增殖，促進細胞凋亡，使白血病細胞更多的阻滯于G0/G1期。③過表達DACT1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路影響白血病細胞的生物學行為。④過表達DACT1可以增加KG1 a細胞對柔紅霉素的化療敏感