三帶喙庫蚊種群特征及感染流行性乙型腦炎病毒的研究.pdf

1、流行性乙型腦炎（Japanese Encephalitis,JE），簡稱乙腦，是一種重要的蚊媒傳染病，其傳播媒介主要是三帶喙庫蚊（Culex tritaeniorhynchus），病原體是日本腦炎病毒（Japanese Encephatlitis virus,JEV），主要感染兒童和青少年，病死率可達10％以上，一半以上的幸存者會留下神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，是人類健康的嚴重威脅。另外，乙腦病毒也容易造成受感染的母豬流產(chǎn)或畸胎，對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。<

2、br>　　為闡明三帶喙庫蚊種群特征及感染流行性乙型腦炎病毒特點，從而科學有效地防控流行性乙型腦炎，本研究主要從生態(tài)學和分子生物學、群體遺傳學等角度開展了三方面研究：
　　1.流行性乙型腦炎主要媒介三帶喙庫蚊種群分布特征研究。
　　在江蘇省長江入?？趦砂哆x擇啟東市和太倉市作為調查地點，調查以雞、豬為誘餌的蚊蟲種類構成和三帶喙庫蚊種群數(shù)量季節(jié)變化，同時調查三帶喙庫蚊在農(nóng)村豬圈、民居和草地等生態(tài)環(huán)境的種群分布。通過收集江蘇省病媒生

3、物監(jiān)測網(wǎng)絡中2009年-2015年蚊蟲監(jiān)測數(shù)據(jù)，對三帶喙庫蚊在城市城區(qū)范圍內公園、居民區(qū)和醫(yī)院不同生境分布和動態(tài)變化進行了分析。
　　研究結果發(fā)現(xiàn)，三帶喙庫蚊以叮吸豬等家畜類血液為主，主要分布于豬圈、牛棚等生境，其次是民居，在江蘇每年從5月開始出現(xiàn)，然后密度逐漸升高，7-8月達到密度高峰，隨后密度逐漸下降，10月基本監(jiān)測不到該蚊種?；陔u為誘餌的三帶喙庫蚊種群數(shù)量較少，在江蘇主要出現(xiàn)在6-8月。研究同時發(fā)現(xiàn)，至少從2009年開始，

4、三帶喙庫蚊已經(jīng)在江蘇各市的城區(qū)范圍內出現(xiàn)，主要分布于公園，居民區(qū)和醫(yī)院等場所分布相對較少，高峰主要出現(xiàn)在8月，這可能是由于農(nóng)村生態(tài)環(huán)境和經(jīng)濟模式改變造成生存壓力所致。
　　2.三帶喙庫蚊線粒體DNA和微衛(wèi)星特征分析。
　　采集三帶喙庫蚊標本，提取基因組DNA，對線粒體全長進行測序。從GenBank檢索下載5屬33種蚊蟲線粒體全長和COⅠ基因序列，與三帶喙庫蚊相應序列構成數(shù)據(jù)，探討線粒體DNA全長用于三帶喙庫蚊分子分類鑒定的可

5、行性和優(yōu)勢。本研究系首次對三帶喙庫蚊線粒體全長進行了測序。通過構建進化樹，對線粒體全長和COⅠ基因用于三帶喙庫蚊分子分類鑒定進行了研究，發(fā)現(xiàn)線粒體基因組全長可以用于三帶喙庫蚊分子分類鑒定，由于序列更長，含有更豐富的生物信息，相對于線粒體上COⅠ基因可以更細致的對蚊蟲種類進行區(qū)分。
　　采集16個地理種群的三帶喙庫蚊，每個地理種群挑選5-6只蚊蟲，每只蚊蟲作為一個樣本提取DNA，設計引物擴增線粒體ND4和ND5基因。分析發(fā)現(xiàn)，ND5

6、基因比ND4基因擁有更高比例的多態(tài)性位點和更多的單倍型數(shù)，相對更適合做種群進化分析的分子標記。三帶喙庫蚊ND4和ND5單倍型與地理位置無明顯對應關系，種群間分化程度小。
　　采集20個地理種群的三帶喙庫蚊，每個地理種群挑選30只蚊蟲，每只蚊蟲作為一個樣本提取DNA，設計引物篩選出10個微衛(wèi)星DNA位點。PCR擴增后對微衛(wèi)星 DNA數(shù)據(jù)進行種群遺傳學分析。結果表明，本研究中單地點30次重復采樣能夠代表對應地理種群的整體情況，20個地

7、理種群的觀察雜合度均低于預期雜合度，種群近交系數(shù)基本在0.1以上，10個位點群體間近交系數(shù)（0.141）大于群體內近交系數(shù)（0.006），10個微衛(wèi)星位點的基因流平均值為10.4703，64.7%的種群間成對固定指數(shù)Fst未表現(xiàn)出明顯的遺傳分化，這些參數(shù)結果表明三帶喙庫蚊種群間近交明顯，基因交流頻繁。
　　3.三帶喙庫蚊和宿主攜帶流行性乙型腦炎病毒和病毒基因組特征分析。
　　2015-2016年在江蘇省4個城市9個地點的豬圈

8、中以誘蚊燈法采集三帶喙庫蚊，其中連云港小高莊和新灘村在2015年和2016年分別在同一地點進行了2次采集，其余地點均為2016年采集。以50只蚊蟲為一組，提取RNA，設計引物，RT-PCR法擴增乙腦病毒核酸。結果顯示，乙腦病毒在三帶喙庫蚊中的感染比例較高，本研究中，陽性樣本份數(shù)比例基本在10%以上，近一半在50%以上，最高為泰州張家院村，達到了80%。最小感染率（IR）也有近一半在10%以上，最高為16.00‰，而最大似然估計值（MLE

9、）比相應的最小感染率值都大，感染情況越嚴重，兩者的誤差越大。
　　2014年在江蘇省分別采集小葦鶼、小白鷺和池鷺血清樣本13、12和2份，提取核酸后進行PCR擴增，未檢測出乙腦病毒。2014年3-10月，每月在啟東和太倉分別采集幼豬和母豬血清標本，以ELISA法檢測抗乙腦病毒IgG抗體，以乳膠凝集法檢測IgM抗體，結果發(fā)現(xiàn)豬對乙腦病毒IgM和IgG抗體自6月開始升高，7-8月達到高峰，9月開始逐漸下降。將抗體陽性的血清標本提取核酸

10、檢測乙腦病毒，未發(fā)現(xiàn)陽性。2014年4-9月，每月在屠宰場采集豬腦，提取核酸檢測乙腦病毒，結果在228份豬腦中均未檢出乙腦病毒核酸。
　　從三帶喙庫蚊每個地理種群乙腦病毒檢測陽性的標本中挑選1-2份對乙腦病毒E基因進行測序。2015-2016年共獲得17株乙腦病毒的E基因序列，其中2015年從連云港3地的三帶喙庫蚊中獲得4株乙腦病毒E基因序列，2016年從宿遷、南京、泰州和連云港的三帶喙庫蚊中獲得12株乙腦病毒的 E基因序列，從泰

11、州張家院十四組的中華按蚊中獲得1株乙腦病毒的E基因序列。根據(jù)E基因序列構建進化樹進行基因分型，17株乙腦病毒在基因型上均屬于GⅠ-b型，氨基酸序列與減毒疫苗株SA14-14-2比較，抗原關鍵位點E332、E304和E335相同。17株乙腦病毒毒力關鍵位點E138和E176相同，但與SA14-14-2株不同，表明17株乙腦病毒與SA14-14-2株抗原性相似，但毒力可能強于SA14-14-2，這表明基于SA14-14-2的乙腦疫苗目前在江