miR--200家族在斑馬魚生殖發(fā)育中的功能研究.pdf

1、斑馬魚miR-200家族(miR-200s)有六個成員:miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429a和miR-429b，分布在斑馬魚的6號和23號染色體上。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)miR-200家族基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中調控胚胎的體長，然而miR-200在成魚中的功能還鮮有報道。本研究旨在探索miR-200家族在成魚斑馬魚生殖發(fā)育中的功能。通過CRISPR/CAS9基因編輯技術，我們刪除了斑馬魚基

2、因組上miR-200家族的6個前體。6號染色體上miR-200家族成員(miR-141、miR-429b和miR-200c)敲除的突變體斑馬魚（下文簡稱6號miR-200敲除系，chr6-miR-200-KO）沒有出現(xiàn)任何異于野生型(WT)斑馬魚的表型;23號染色體上miR-200家族成員(miR-200b、miR-200a和miR-429a)敲除的突變體(下文簡稱23號miR-200敲除系，chr23-miR-200-KO)雄魚的精子

3、運動能力顯著高于WT斑馬魚，同時23號miR-200敲除系雌魚不能正常繁殖。
　　在雄魚中，通過解剖觀察WT和突變體的精巢形態(tài)和HE切片的組織學分析，發(fā)現(xiàn)兩種突變體與WT相比并無任何異常;而后通過計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)檢測了斑馬魚的精子運動能力，分析結果顯示6號miR-200敲除系突變體的精子運動能力與WT斑馬魚無顯著性差異，然而23號miR-200敲除系突變體的精子運動能力顯著高于WT斑馬魚和6號miR-200敲除系

4、突變體。通過targetscan軟件在線預測與精子生成及精子運動能力相關的miR-200的靶基因，我們篩選出了amh、wt1a和srd5a2b三個候選靶基因，并且在WT和23號miR-200敲除系突變體中的定量PCR結果也證實它們與miR-200的靶向關系。體外熒光素酶報告系統(tǒng)的結果顯示，miR-200a、miR-200b、miR-429a能夠靶向結合amh、wt1a和srd5a2b的3'UTR。在體內，通過在成魚中注射miR-200a

5、、miR-200b、miR-429a穩(wěn)定的模擬物以達到模擬過表達miR-200a、miR-200b、miR-429a的目的，結果顯示過表達miR-200a、miR-200b、miR-429a的雄魚的精子運動能力顯著下降，同時精巢中amh、wt1a和srd5a2b的表達也顯著下調。之前的實驗結果證實p53是miR-200的直接上游，而后我們檢測了p53突變體中的miR-200a、miR-200b和miR-429a的表達，發(fā)現(xiàn)突變體中這三者

6、的表達量異常低于WT;通過CASA檢測發(fā)現(xiàn)，p53突變體的雄魚精子運動能力顯著高于WT。WT斑馬魚雄魚的梯度雌二醇浸泡實驗結果顯示，梯度的雌二醇可以誘導miR-429a梯度上調表達和精子運動能力的下降，同時p53的表達顯著上升，然而對p53突變體進行同樣的雌二醇浸泡操作發(fā)現(xiàn)p53突變體的精子運動能力并沒有受到雌二醇的影響。于是，我們得出以下結論:雌二醇可通過激活p53途徑直接作用于miR-200a、miR-200b和miR-429a，影

7、響下游靶基因amh、wt1a和srda2b的表達，導致最終的精子運動能力受影響。
　　在雌魚中，我們發(fā)現(xiàn)23號miR-200敲除系突變體不能正常繁殖，而6號miR-200敲除系突變體的生殖能力與WT斑馬魚無異。通過對性成熟的斑馬魚雌魚進行解剖及切片的比較觀察，發(fā)現(xiàn)6號miR-200敲除系和23號miR-200敲除系突變體與WT的卵巢沒有差異，并且23號miR-200敲除系突變體和WT一樣，里面各個時期的卵母細胞都存在，并無差異。而

8、后，通過更細致的觀察，我們發(fā)現(xiàn)23號miR-200敲除系突變體雌魚和WT的卵細胞均可正常發(fā)育到Ⅵ期，并且均可在體外誘導達到最終的卵母細胞成熟階段。通過hCG的催產(chǎn)挽救，23號miR-200敲除系突變體可以被部分挽救，并且催產(chǎn)后突變體中的卵細胞均透明達到排卵前的階段，但大部分突變體的成熟卵細胞不能從濾泡細胞中脫落進入卵巢腔，不能人工擠出自由的卵細胞。促性腺激素的主要成分為LH和FSH，在斑馬魚中，fshb突變體雌魚沒有出現(xiàn)任何生殖障礙，所

9、以我們鎖定LH在整個排卵過程中發(fā)揮著非常重要的作用。通過qPCR的檢測，發(fā)現(xiàn)在突變體中l(wèi)hb的表達明顯低于WT，同時我們檢測了在23號染色體上的miR-200s的靶基因wt1a的表達，并且驗證了lhb的啟動子活性可以有效的被Wt1a蛋白抑制。于是我們得出結論23號染色體上的miR-200通過調控下游靶基因wt1a的轉錄來調控lhb的表達。那LH又是如何影響斑馬魚的成熟及排卵的呢？我們猜測這一系列的排卵缺陷是由LH的下降引起下游的孕激素及

10、前列腺素在排卵過程中的不足導致的。于是我們驗證這兩個激素在排卵中的作用。在WT斑馬魚排卵前，DHP在早上5點半左右達到最高水平，通過注射DHP發(fā)現(xiàn)和hCG挽救結果一致，23號miR-200敲除系突變體雌魚可以被部分挽救，這也就證實了我們的一個猜想，突變體的生殖障礙有一部分原因是由于LH下調導致排卵前孕酮供應不足導致不能正常成熟及排卵。另一方面，通過檢測發(fā)現(xiàn)ptgs2a在排卵前顯著上升，然而前列腺素PGE2和PGF2并不能挽救23號miR

11、-200敲除系突變體雌魚。與此同時，我們構建了斑馬魚ptgs2a敲除的突變體來確定前列腺素在生殖過程中的作用，結果發(fā)現(xiàn)ptgs2a突變體雌魚是可育的，并沒有出現(xiàn)任何排卵障礙。于是我們得出結論，前列腺素并沒有參與miR-200調控LH誘導卵細胞成熟及排卵的這個過程?？偨Y23號染色體上的miR-200成員在雌魚中的作用，我們得出以下結論:斑馬魚23號染色體上的miR-200成員miR-200a、miR-200b和miR-429a可以通過靶向