bFGF干預對體外壓瘡深部組織肌細胞氧化應激作用及其機制探討.pdf

1、壓瘡深部組織損傷（Deep Tissue Injury，DTI）好發(fā)于受壓骨隆突處，為壓瘡中最為嚴重分期，亦為臨床護理重點和難點。此類壓瘡具有皮膚深部組織肌層損傷的特點，局部持續(xù)受壓時，血流灌注受阻、產生大量自由基造成肌細胞損傷。其發(fā)生潛匿，早期難以發(fā)現(xiàn)，極易發(fā)展為難愈性創(chuàng)面。目前壓瘡機制研究集中于動物實驗，尚未有針對DTI機制的體外細胞干預性研究。堿性成纖維生長因子(bFGF)是一種多能細胞生長因子，對多種細胞損傷效果確切，因此，建立

2、體外DTI模型，在細胞水平探討bFGF調控骨骼肌細胞氧化應激機制及其相關蛋白表達，或許能夠深入理解深部組織損傷，為其防治提供新視野。
　　第一部分:體外壓瘡深部組織肌細胞氧化應激模型構建
　　目的:構建體外壓瘡深部組織細胞氧化應激模型，為進一步在細胞層面探討壓瘡深部組織損傷機制建立基礎。
　　方法:選取對數(shù)生長期大鼠成肌細胞，分為對照組及5個實驗組。對照組行常規(guī)培養(yǎng)，5個實驗組分別采用50、100、150、200、25

3、0μmol/L過氧化氫處理1-4 h后檢測四氮甲基唑藍(MTT)，根據MTT結果重點觀察不同氧化應激水平作用4小時后乳酸脫氧酶(LDH)變化、肌細胞Hoechst染色及形態(tài)學改變。
　　結果:1.對照組1至4h細胞存活為100％，細胞活性無明顯變化。
　　2.實驗組過氧化清濃度在100μmol/L以下具有促細胞增殖作用，高于100μmol/L在2h后均呈損傷趨勢，至4h大鼠成肌細胞存活率為20％-75％不等。
　　3.

4、大鼠成肌細胞形態(tài)隨氧化應激程度加重而縮收，細胞間隙漸增。
　　4.Hoechst細胞熒光染色顯示100μmo/L過氧化氫作用4h已有較多肌細胞趨向凋亡。
　　5.成肌細胞在100μmo/L過氧化氫作用4小時后LDH釋放率相比對照組具有顯著性差異。
　　結論:1.大鼠成肌細胞隨氧化應激程度加重，肌細胞活力下降伴隨細胞膜通透性增加及胞核漸進性凋亡的發(fā)展過程。
　　2.經100μmo/L過氧化氫作用4h的成肌細胞可作為

5、研究壓瘡深部組織細胞氧化應激的體外模型。
　　第二部分:bFGF干預在體外壓瘡深部組織肌細胞損傷中的作用
　　目的:在已構建體外DTI氧化應激模型基礎上，探討bFGF在大鼠成肌細胞氧化應激損傷中的保護作用
　　方法:常規(guī)進行細胞培養(yǎng)，待細胞生長為指數(shù)增長期后，統(tǒng)一換液。根據有無H2O2及bFGF干預可分為四組:正常對照組(Con)，單純bFGF組(bFGF)，氧化應激組(H2O2)及干預組(bFGF+H2O2)。氧化應

6、激組過氧化氫及時間點的確定參照R.Dhanya等研究方法及我們前期體外DTI細胞氧化應激模型構建過程[43，51])，干預組(bFGF+H2O2，bFGF濃度綜合參考Wang等[52,53]研究)。正常對照組不做任何處理。單純bFGF組:提前給予100 ng/ml bFGF2 h。氧化應激組:采用100μmol/L雙氧水培養(yǎng)基處理4h。干預組:100 ng/ml bFGF預給2h后，加入100μnmol/L雙氧水繼續(xù)孵育4h。各組于實驗

7、終點分別進行多水平檢測。免疫熒光分析肌細胞活性氧自由基水平，Bax及細胞色素C表達情況;SABC免疫組織化學法于倒置顯微鏡下觀察Bcl-2與Bax表達變化;蛋白印跡檢測肌細胞PARP,PCNA等蛋白表達趨勢。
　　結果:1.氧自由基表達情況:活性氧自由基顯示氧化應激組中大鼠成肌細胞ROS熒光表達呈強陽性，細胞突觸變短，胞質回縮明顯。干預組相比應激組氧化應激強度顯著下降(p＜0.01）。
　　2.免疫組化結果顯示:正常對照組及

8、單純bFGF組大鼠成肌細胞胞質中含有大量Bcl-2顆粒，僅少數(shù)細胞少量表達Bax顆粒;應激組Bcl-2陽性顆粒銳減，而Bax表達顯著增加;若于造模前提前給予bFGF干預2小時，則可上調Bcl-2水平，抑制Bax表達。
　　3.間接免疫熒光方法檢測Bax、Cyt.C蛋白。結果顯示:正常對照組及單純bFGF組Bax及Cyt.C熒光較弱。氧化應激組Bax熒光表達呈強陽性，同時Cyt.C滲入胞外，呈紅色彌漫性熒光顆粒。而含有bFGF的干預

9、組Bax熒光強度明顯減弱，Cyt.C仍局限于胞質，熒光顆粒亮度減弱。
　　4.Western blot檢測顯示正常對照組及單純bFGF組Bax蛋白，Cyt.C及PARP蛋白呈現(xiàn)低水平表達，PCNA水平較高;氧化應激組Bax、Cyt.C及PARP蛋白表量明顯增加，細胞增殖分裂進程受阻;干預組能夠顯著下調大鼠成肌細胞Bax蛋白、細胞Cyt.C及PARP水平，同時增加Bcl-2、PCNA表達量。
　　結論:1.外源性bFGF能夠通