神經(jīng)源性疼痛形成過(guò)程中MrgD受體作用的研究.pdf

1、神經(jīng)源性疼痛(Neuropathic Pain)是由于神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)損傷或功能障礙而引起的疼痛綜合征，主要表現(xiàn)為痛覺(jué)過(guò)敏、異常痛敏和自發(fā)性疼痛等。神經(jīng)源性疼痛的發(fā)病機(jī)制不清，是當(dāng)今困擾人類(lèi)較為嚴(yán)重的臨床問(wèn)題之一。目前對(duì)神經(jīng)源性疼痛尚沒(méi)有特效的治療藥物，常用阿片類(lèi)和中樞神經(jīng)抑制劑控制疼痛，但阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥對(duì)部分神經(jīng)源性疼痛幾乎無(wú)效，而作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物副作用較大，限制了藥物的劑量，使其不能達(dá)到有效的鎮(zhèn)痛作用。因而，探尋神經(jīng)源性疼痛的發(fā)

2、病機(jī)制，尋求作用于脊髓或外周部位、不具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用的藥物，顯得尤為迫切。
　　 Mrgs(Mas-related genes)相關(guān)受體是2001年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)與疼痛密切相關(guān)的新型G蛋白偶聯(lián)受體，其內(nèi)源性配體主要有阿片肽和神經(jīng)肽，由于阿片肽前體的水解片斷能高效激活Mrgs受體，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，所以被定義為外周阿片受體。Mrgs受體家族中大部分成員的mRNA都特異地、以非重疊形式表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root gang

3、lion，DRG)的小直徑感覺(jué)神經(jīng)元上。這種特異性表達(dá)模式提示，該家族受體很可能成為研發(fā)無(wú)中樞副作用的鎮(zhèn)痛藥物的潛在靶點(diǎn)。
　　 本研究選用大鼠神經(jīng)源性疼痛模型，探討外周阿片受體與疼痛的關(guān)系。Mrgs受體在大鼠體內(nèi)的亞型主要有MrgA、B、C、D等多種，其中MrgD亞型的表達(dá)量較多，尤其是在DRG非肽能、小直徑IB4+神經(jīng)元上表達(dá)，與ATP門(mén)控離子通道腺苷受體(P2X3)和辣椒素受體(VR1)相互重疊分布。已有研究表明，P2X3

4、和VR1受體均參與了神經(jīng)源性痛的外周機(jī)制，那么MrgD受體也有可能參與了神經(jīng)源性痛的發(fā)病過(guò)程。因此，本研究以MrgD受體為靶標(biāo)，觀察其在動(dòng)物和細(xì)胞水平的表達(dá)變化。
　　 研究目的：觀察在痛敏形成和發(fā)展過(guò)程中MrgD受體在DRG、脊髓和脊髓上水平表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，以及不同類(lèi)型的藥物干預(yù)對(duì)MrgD受體激動(dòng)狀態(tài)的影響。
　　 研究方法：建立大鼠神經(jīng)源性疼痛模型，用Von frey filament測(cè)定機(jī)械痛覺(jué)超敏和痛覺(jué)過(guò)敏，用熱

5、輻射刺激引起縮足的潛伏期代表對(duì)熱刺激的敏感程度，并以此來(lái)確定痛敏的形成；采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分析方法測(cè)定MrgD受體的表達(dá)量；將MrgD基因定向克隆于含有不同標(biāo)簽的真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用細(xì)胞定位、免疫共沉淀等方法驗(yàn)證MrgD二聚體的形成。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.建立了坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(CCI)模型、脊神經(jīng)結(jié)扎模型(SNL)和中樞神經(jīng)損傷強(qiáng)啡肽(DYN)模型。通過(guò)對(duì)三種神經(jīng)源性疼痛

6、動(dòng)物模型綜合分析和比較，我們采用慢性壓迫坐骨神經(jīng)損傷(CCI)模型來(lái)研究MrgD受體和神經(jīng)源性疼痛的關(guān)系。
　　 2.在CCI模型上進(jìn)行藥物治療，結(jié)果顯示，MrgD受體非選擇性激動(dòng)劑BAM22P、阿片受體激動(dòng)劑嗎啡和抗癲癇藥加巴噴丁均具有鎮(zhèn)痛作用，其中嗎啡作用最強(qiáng)；同時(shí)給予BAM22P和阿片受體拮抗劑Naloxone，BAM22P仍顯示出鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用可能是通過(guò)MrgD受體起作用的。
　　 3.分析MrgD受體的表

7、達(dá)與神經(jīng)源性疼痛發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。在正常動(dòng)物DRG和脊髓上，我們發(fā)現(xiàn)MrgD受體以單體和二聚體兩種形式存在；在MrgD受體表達(dá)與神經(jīng)源性疼痛(CCI模型)的關(guān)系方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MrgD受體mRNA和蛋白在神經(jīng)源性疼痛的形成過(guò)程中均表達(dá)增加，其中造模3d時(shí)，DRGMrgD受體mRNA和蛋白表達(dá)量達(dá)到最高；造模7d時(shí)，脊髓MrgD受體mRNA和蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。以上結(jié)果說(shuō)明MrgD受體的表達(dá)與神經(jīng)源性疼痛具有一定的相關(guān)性。當(dāng)用上述藥物干

8、預(yù)后，在BAM22P刺激作用下，MrgD受體單體和二聚體水平發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化，單體表達(dá)量升高，二聚體表達(dá)量下降。
　　 4.構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)重組rMrgD受體的HEK293細(xì)胞株。利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，從總RNA中擴(kuò)增出目的基因，克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1myc-hisB和pcMV-HA中，構(gòu)建真核表達(dá)rMrgD載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞得到重組質(zhì)粒表達(dá)細(xì)胞株。通過(guò)免疫熒光和western blot方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物

9、進(jìn)行鑒定。直接和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)皆表明rMrgD主要定位于細(xì)胞膜上，western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)rMrgD在HEK293細(xì)胞主要以單體和二聚體形式存在；瞬時(shí)共轉(zhuǎn)帶有HA和myc標(biāo)簽的重組rMrgD質(zhì)粒，通過(guò)免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)rMrgD自身能夠形成二聚體，這為進(jìn)一步研究MrgD受體的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.在已建立的三種模型上對(duì)新型鎮(zhèn)痛藥Seselin及衍生物進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，Seselin在CCI模型上的鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)

10、(48％)，比對(duì)照藥阿司匹林(10％)強(qiáng)，但比Gab(76％)弱；在SNL模型上Seselin的鎮(zhèn)痛作用較弱；在強(qiáng)啡肽模型上沒(méi)有明顯鎮(zhèn)痛作用。在SNL模型上對(duì)Seselin衍生物進(jìn)行藥效學(xué)初步評(píng)價(jià)，其中三個(gè)化合物顯示出了比Seselin較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，鎮(zhèn)痛活性還需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)論：本研究從mRNA和蛋白水平首次證明MrgD受體在神經(jīng)源性疼痛的形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，Mrgs受體非選擇性激動(dòng)劑BAM22P具有鎮(zhèn)痛作用，作