炎性細胞因子對人臍靜脈內(nèi)皮細胞PAPP-A、VEGF、ICAM-1蛋白分泌的影響.pdf

1、急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）目前仍然是引起冠心病死亡的最主要病因，它嚴重威脅人類的生命健康。ACS是包括不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）、急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）和急性缺血性心源性猝死（sudden cardiogenic death，SCD）在內(nèi)的一組臨床綜合征。由于上述三種臨床類型都有突然發(fā)病的

2、特點，使人們想到其發(fā)病機制可能有共同的病理生理基礎。目前認為其發(fā)病機制主要是與中性粒細胞和單核細胞粘附到血管內(nèi)皮細胞觸發(fā)炎癥反應及氧化低密度脂蛋白沉積，冠狀動脈不穩(wěn)定粥樣斑塊形成有關。 冠狀動脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成冠脈急性狹窄或閉塞是導致ACS的重要原因。目前研究認為，AS是對局部損傷的一種保護性炎癥-纖維增殖性回應，這種回應一旦變得過度，最終導致粥樣斑塊

3、形成。炎癥貫穿了AS的始終，而由炎癥引起的內(nèi)皮細胞損傷及其功能減退是AS發(fā)生、發(fā)展最重要的始動因素；參與AS形成的炎癥因子有很多，其中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）不僅可以損傷內(nèi)皮功能及削弱內(nèi)皮對舒血管物質的反應，而且誘導血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MC

4、P-1），后者在趨化單核細胞黏附冠狀動脈內(nèi)膜參與粥樣斑塊的形成發(fā)揮著重要的作用；而單核細胞與血管內(nèi)皮細胞相互黏附可進一步促進MCP-1、TNF-α、IL-1β、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF）等細胞因子的表達，進而激活單核-巨噬細胞、平滑肌細胞遷移至局部粥樣斑塊中形成泡沫細胞。有研究進一步發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β等細胞因子一方面

5、可以誘導平滑肌細胞的凋亡，由于大量平滑肌細胞凋亡使斑塊肩部無法發(fā)揮支撐作用，不能維持斑塊的組織結構，使斑塊不穩(wěn)定而易于破裂。另一方面粥樣斑塊中的TNF-α，和IL-1β還可以促使巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs），加快粥樣斑塊細胞外基質的溶解，最終導致斑塊的破裂。目前已經(jīng)證實：ACS的發(fā)生與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關，導致斑塊不穩(wěn)定的因素包括炎癥反應的過度激活、斑塊基質的降解、凝血機制的

6、變化等，其中炎癥反應在易損斑塊（vulnerable plaque，VP）的發(fā)生、演變以及斑塊破裂過程中自始至終都起著至關重要的作用。VP含有大量的巨噬細胞、單核細胞等炎性細胞，它們大量分泌如IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細胞因子，參與ACS的病理過程。 隨著對VP研究的深入發(fā)現(xiàn)，除了TNF-α、IL-1β等促炎癥因子，一系列斑塊穩(wěn)定性相關血清活性物質對斑塊的衍變也有重要影響。妊娠相關血漿蛋白A（pregnancy as

7、sociated plasma protein-A，PAPP-A）是新近發(fā)現(xiàn)的與斑塊穩(wěn)定性密切相關的一種MMPs，它可通過多個渠道參與ACS的病理過程。作為MMPs一員，推測PAPP-A可能是炎癥因子或其它冠心病的危險因素作用于單核/巨噬細胞或血管平滑肌細胞釋放的一種物質，該物可能同樣具有消解粥樣斑塊的纖維帽作用；PAPP-A也可能通過胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）作用引起炎性細

8、胞因子釋放及炎癥細胞激活而引起動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定。除了炎癥，斑塊內(nèi)血管生成在AS發(fā)生、發(fā)展及其相關的臨床綜合征的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。導致斑塊內(nèi)血管生成的機制與因素目前尚不清楚，也是目前研究的熱點。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂的生長因子，具有特異性促進血管新生之作用，而血管新生又可促進AS之進程，使薄壁的滋養(yǎng)

9、血管很容易破裂，造成斑塊內(nèi)出血，進而形成血栓引發(fā)UAP、MI等嚴重心血管事件。越來越多的證據(jù)表明，VEGF對AS的進展和斑塊不穩(wěn)定性有密切關系，VEGF可通過炎癥浸潤和促進新生血管形成等機制促進粥樣硬化損傷的進展。細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）介導的白細胞的黏附增加可促進斑塊的不穩(wěn)定，削弱斑塊處的纖維帽，加速斑塊裂隙，最終促進斑塊破裂，血栓形成，臨床表現(xiàn)為UAP和A

10、MI的發(fā)生。新生血管內(nèi)皮上常有高水平的ICAM-1，這些高表達的粘附分子是單核-巨噬細胞向病變部位遷移的重要的調(diào)節(jié)因素，從而形成了一個促進病變部位血管發(fā)生的正反饋調(diào)節(jié)機制。 因此，冠狀動脈粥樣斑塊中產(chǎn)生的多種細胞因子互相誘導、互相協(xié)作，形成了復雜的細胞因子網(wǎng)絡，最終促進了不穩(wěn)定脈粥樣斑塊的形成。更為重要的是通過國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，炎性細胞因子和一系列斑塊穩(wěn)定性相關的血清活性物質有著密切的關系：上述血清活性物質物的表達受炎性細胞因子的

11、調(diào)節(jié)而參與炎癥反應，但是這些研究主要集中在在人成骨細胞、人皮成纖維細胞中；而針對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的報道較少。本研究以上述研究為參考和基礎，分析炎性細胞因子在蛋白分泌水平上對HUVEC表達上述血清活性物質的影響，以進一步探討ACS中炎癥與血清活性物質的相互關系和作用機制及VEGF與PAPP-A之間的相關性，從而揭示AS發(fā)生機制，為ACS的防治提供重要

12、的靶點。 目的： 研究炎性細胞因子IL-1β和TNF-α對HUVEC中PAPP-A、VEGF、ICAM-1蛋白表達的影響以及PAPP-A與VEGF之間的相互關系，進一步探討炎癥因素及新生血管形成在ACS中的作用機制。 方法： HUVEC在37℃，95％空氣和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳至3-5代后，將細胞按1×105/c㎡密度接種于5c㎡培養(yǎng)皿中。24小時后換液，在細胞接近80％融合時加入不同干預因子進行刺

13、激；根據(jù)不同干預因素分成兩大組：1、對照組、SU5416組、IL-1β組、IL-1 β+SU5416組、TNF-a組、TNF-a+SU5416組、IL-1β+TNF-α組、IL-1β+TNF-a+SU5416組；2、對照組、PAPP-A受體阻斷劑組、IL-1β組、IL-1β+PAPP-A受體阻斷劑組、TNF-a組、TNF-a+PAPP-A受體阻斷劑組、IL-1β+TNF-α組、IL-1β+TNF-a+PAPP-A受體阻斷劑組：每孔培養(yǎng)液

14、均為1ml，IL-1β、TNF-α終濃度為10ng/ml，PAPP-A受體阻斷劑終濃度為20uM，F(xiàn)lk-1（VEGF受體）特異性阻斷劑SU5416終濃度為1μmol/L，在共同培養(yǎng)24h后收集細胞培養(yǎng)液上清，上清液-70℃凍存待統(tǒng)一測定，應用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液內(nèi)PAPP-A、VEGF、ICAM-1的蛋白表達量。所得數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學描述與分析，計量資料用x±s表示，數(shù)據(jù)分析使用的統(tǒng)計學方法有析因設

15、計資料的方差分析（two-way classification ANOVA）、多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗（K Independent Samples Test），兩獨立樣本t檢驗（其中，方差不齊的組采用的是Welch-Satterthwaite approximate t test）；p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結論： 1、炎性細胞因子IL-1β、TNF-α能促進HUVEC斑塊穩(wěn)定相關血清活性物質PAPP-A、VEG

16、F、ICAM-1的蛋白分泌，說明炎性細胞因子和炎癥反應可能對HUVEC上述血清活性物質的旁分泌起著調(diào)節(jié)作用。 2、炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-1β+TNF-α對PAPP-A、VEGF的促分泌作用相同，同時使用炎性因子與VEGF受體阻斷劑干預后PAPP-A的分泌明顯低于炎性因子單獨干預組，而使用炎性因子與PAPP-A受體阻斷劑干預后VEGF的分泌也明顯低于炎性因子單獨干預組，說明PAPP-A與VEGF之間具有一定的相