氧化低密度脂蛋白通過Akt-mTOR-p70S6K途徑誘導內皮細胞自噬.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩43頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、研究目的:
  自噬是一個在生物進化上相對保守的過程,涉及長壽蛋白的降解;它在細胞的生長、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮了重要的作用。氧化應激可以誘導自噬活動的發(fā)生,從而促進細胞內受損及有害物質的降解。在我們的研究中,主要探討氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)自噬中的作用及其對Akt/mTOR/p70S6K信號通路的影響。
  研究方法:
  傳代培養(yǎng)HUVECs,選用透氣的細胞培養(yǎng)瓶、DMEM

2、培養(yǎng)基(含10%胎牛血清+100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素),細胞呈現(xiàn)出貼壁生長狀態(tài),放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24小時后換液繼續(xù)培養(yǎng),并注意觀察細胞生長情況,約兩天傳一代,選用第四代HUVECs,以10*10^4/ml的細胞密度接種于六孔板中,每個孔內接種2ml,然后取對數(shù)生長期的細胞,將培養(yǎng)的HUVECs分為ox-LDL組和對照組,分別加入100ug/ml ox-LDL和等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS),培

3、養(yǎng)6h、12h后,收集細胞,應用透射電子顯微鏡觀察自噬體,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)方法檢測LC3、p62 mRNA表達水平;蛋白質印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot方法檢測LC3、p62、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、P-p70S6K/p70S6K蛋白表達水平。
  研究結果:
  1.經(jīng)ox-LDL(100ug/ml)處理HUVECs6小時和12小時,后用透射電子

4、顯微鏡觀察細胞的超微結構變化。透射電鏡顯示,對照組細胞核膜完整,染色質結構正常,胞漿內各細胞器、細胞核形態(tài)和分布基本正常,未見明顯自噬空泡,溶酶體數(shù)目未見明顯增多。Ox-LDL(100ug/ml)作用于HUVECs6h、12h后,細胞質中可見包含部分細胞質內成分、雙層膜結構的自噬體,表明ox-LDL可誘導HUVECs發(fā)生自噬。自噬體可能源自無核糖體內質網(wǎng)分離的膜,這些分離的膜伸長,在兩端彎曲以形成C形結構和雙膜液泡,當自噬體與溶酶體融合

5、時,內膜消失,自噬體變成單膜自噬泡。并且,6h處理組中的自噬體數(shù)量高于12h處理組。
  2.LC3-Ⅱ的檢測作為自噬激活的標志物,與對照組相比,處理組細胞顯示LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達水平增加,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。此外,我們發(fā)現(xiàn)處理組細胞中p62的mRNA和蛋白表達水平降低,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。表明,p62與自噬效應蛋白LC3存在相互作用,并通過自噬溶酶體途徑降解。
  3.Ox-LDL處理組細

6、胞中的P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、P-p70S6K/p70S6K的蛋白表達水平低于對照組,P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義,主要表現(xiàn)為ox-LDL抑制了Akt/mTOR/p70S6K信號傳導通路中磷酸化蛋白P-Akt、P-mTOR、P-p70S6K的表達水平;然而,對信號傳導通路中總蛋白Akt、mTOR、p70S6K的表達水平影響不大。
  研究結論:
  在本研究中,我們提供證據(jù)表明ox-LDL(100ug/

7、ml)可以誘導HUVECs發(fā)生自噬。并且,我們的研究證明在ox-LDL處理HUVECs6小時和12小時后自噬體的數(shù)量顯著增加;與對照組相比,LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達水平上調,而ox-LDL處理組中p62的水平下調;這種效應與12小時處理組相比,6小時處理組中的作用更為顯著。并且,Akt/mTOR/p70S6K信號傳導通路中P-Akt、P-mTOR、P-p70S6K的表達水平降低?;诖?,我們認為ox-LDL(100ug/ml)通過

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論