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文檔簡介
1、研究目的:
自噬是一個在生物進化上相對保守的過程,涉及長壽蛋白的降解;它在細胞的生長、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮了重要的作用。氧化應激可以誘導自噬活動的發(fā)生,從而促進細胞內受損及有害物質的降解。在我們的研究中,主要探討氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)自噬中的作用及其對Akt/mTOR/p70S6K信號通路的影響。
研究方法:
傳代培養(yǎng)HUVECs,選用透氣的細胞培養(yǎng)瓶、DMEM
2、培養(yǎng)基(含10%胎牛血清+100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素),細胞呈現(xiàn)出貼壁生長狀態(tài),放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24小時后換液繼續(xù)培養(yǎng),并注意觀察細胞生長情況,約兩天傳一代,選用第四代HUVECs,以10*10^4/ml的細胞密度接種于六孔板中,每個孔內接種2ml,然后取對數(shù)生長期的細胞,將培養(yǎng)的HUVECs分為ox-LDL組和對照組,分別加入100ug/ml ox-LDL和等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS),培
3、養(yǎng)6h、12h后,收集細胞,應用透射電子顯微鏡觀察自噬體,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)方法檢測LC3、p62 mRNA表達水平;蛋白質印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot方法檢測LC3、p62、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、P-p70S6K/p70S6K蛋白表達水平。
研究結果:
1.經(jīng)ox-LDL(100ug/ml)處理HUVECs6小時和12小時,后用透射電子
4、顯微鏡觀察細胞的超微結構變化。透射電鏡顯示,對照組細胞核膜完整,染色質結構正常,胞漿內各細胞器、細胞核形態(tài)和分布基本正常,未見明顯自噬空泡,溶酶體數(shù)目未見明顯增多。Ox-LDL(100ug/ml)作用于HUVECs6h、12h后,細胞質中可見包含部分細胞質內成分、雙層膜結構的自噬體,表明ox-LDL可誘導HUVECs發(fā)生自噬。自噬體可能源自無核糖體內質網(wǎng)分離的膜,這些分離的膜伸長,在兩端彎曲以形成C形結構和雙膜液泡,當自噬體與溶酶體融合
5、時,內膜消失,自噬體變成單膜自噬泡。并且,6h處理組中的自噬體數(shù)量高于12h處理組。
2.LC3-Ⅱ的檢測作為自噬激活的標志物,與對照組相比,處理組細胞顯示LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達水平增加,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。此外,我們發(fā)現(xiàn)處理組細胞中p62的mRNA和蛋白表達水平降低,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。表明,p62與自噬效應蛋白LC3存在相互作用,并通過自噬溶酶體途徑降解。
3.Ox-LDL處理組細
6、胞中的P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、P-p70S6K/p70S6K的蛋白表達水平低于對照組,P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義,主要表現(xiàn)為ox-LDL抑制了Akt/mTOR/p70S6K信號傳導通路中磷酸化蛋白P-Akt、P-mTOR、P-p70S6K的表達水平;然而,對信號傳導通路中總蛋白Akt、mTOR、p70S6K的表達水平影響不大。
研究結論:
在本研究中,我們提供證據(jù)表明ox-LDL(100ug/
7、ml)可以誘導HUVECs發(fā)生自噬。并且,我們的研究證明在ox-LDL處理HUVECs6小時和12小時后自噬體的數(shù)量顯著增加;與對照組相比,LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達水平上調,而ox-LDL處理組中p62的水平下調;這種效應與12小時處理組相比,6小時處理組中的作用更為顯著。并且,Akt/mTOR/p70S6K信號傳導通路中P-Akt、P-mTOR、P-p70S6K的表達水平降低?;诖?,我們認為ox-LDL(100ug/ml)通過
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