氧化低密度脂蛋白通過Akt-mTOR-p70S6K途徑誘導內皮細胞自噬.pdf

1、研究目的：
　　自噬是一個在生物進化上相對保守的過程，涉及長壽蛋白的降解；它在細胞的生長、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮了重要的作用。氧化應激可以誘導自噬活動的發(fā)生，從而促進細胞內受損及有害物質的降解。在我們的研究中，主要探討氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）在人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）自噬中的作用及其對Akt/mTOR/p70S6K信號通路的影響。
　　研究方法：
　　傳代培養(yǎng)HUVECs，選用透氣的細胞培養(yǎng)瓶、DMEM

2、培養(yǎng)基（含10%胎牛血清+100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素），細胞呈現(xiàn)出貼壁生長狀態(tài)，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后換液繼續(xù)培養(yǎng)，并注意觀察細胞生長情況，約兩天傳一代，選用第四代HUVECs，以10*10^4/ml的細胞密度接種于六孔板中，每個孔內接種2ml，然后取對數(shù)生長期的細胞，將培養(yǎng)的HUVECs分為ox-LDL組和對照組，分別加入100ug/ml ox-LDL和等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS），培

3、養(yǎng)6h、12h后,收集細胞，應用透射電子顯微鏡觀察自噬體，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）方法檢測LC3、p62 mRNA表達水平；蛋白質印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot方法檢測LC3、p62、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、P-p70S6K/p70S6K蛋白表達水平。
　　研究結果：
　　1.經(jīng)ox-LDL（100ug/ml）處理HUVECs6小時和12小時，后用透射電子

4、顯微鏡觀察細胞的超微結構變化。透射電鏡顯示，對照組細胞核膜完整，染色質結構正常，胞漿內各細胞器、細胞核形態(tài)和分布基本正常，未見明顯自噬空泡，溶酶體數(shù)目未見明顯增多。Ox-LDL(100ug/ml)作用于HUVECs6h、12h后，細胞質中可見包含部分細胞質內成分、雙層膜結構的自噬體，表明ox-LDL可誘導HUVECs發(fā)生自噬。自噬體可能源自無核糖體內質網(wǎng)分離的膜,這些分離的膜伸長，在兩端彎曲以形成C形結構和雙膜液泡,當自噬體與溶酶體融合

5、時，內膜消失，自噬體變成單膜自噬泡。并且，6h處理組中的自噬體數(shù)量高于12h處理組。
　　2.LC3-Ⅱ的檢測作為自噬激活的標志物，與對照組相比，處理組細胞顯示LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達水平增加，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。此外，我們發(fā)現(xiàn)處理組細胞中p62的mRNA和蛋白表達水平降低，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。表明，p62與自噬效應蛋白LC3存在相互作用，并通過自噬溶酶體途徑降解。
　　3.Ox-LDL處理組細

6、胞中的P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、P-p70S6K/p70S6K的蛋白表達水平低于對照組，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義，主要表現(xiàn)為ox-LDL抑制了Akt/mTOR/p70S6K信號傳導通路中磷酸化蛋白P-Akt、P-mTOR、P-p70S6K的表達水平；然而，對信號傳導通路中總蛋白Akt、mTOR、p70S6K的表達水平影響不大。
　　研究結論：
　　在本研究中，我們提供證據(jù)表明ox-LDL（100ug/

7、ml）可以誘導HUVECs發(fā)生自噬。并且，我們的研究證明在ox-LDL處理HUVECs6小時和12小時后自噬體的數(shù)量顯著增加；與對照組相比，LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達水平上調，而ox-LDL處理組中p62的水平下調；這種效應與12小時處理組相比，6小時處理組中的作用更為顯著。并且，Akt/mTOR/p70S6K信號傳導通路中P-Akt、P-mTOR、P-p70S6K的表達水平降低?；诖?，我們認為ox-LDL（100ug/ml）通過