研究不同培養(yǎng)模式對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：通過(guò)研究間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在不同共培養(yǎng)模式下對(duì)造血干細(xì)胞(HSC)體外增殖的影響，并探究其機(jī)制，從而盡可能真實(shí)地模擬體內(nèi)HSC增殖的骨髓微環(huán)境，尋找更好的促進(jìn)HSC體外增殖的方法。
　　方法：1.C57小鼠MSC分離、培養(yǎng)：采用全骨髓培養(yǎng)法，將C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞，在胎牛血清含量為10％、青-鏈霉素含量為1％、DMEM-F12含量為89％的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第一個(gè)48h行半量換液，此后每隔2天行全量換液一次，于倒置相差

2、顯微鏡下動(dòng)態(tài)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。至培養(yǎng)瓶底面的細(xì)胞長(zhǎng)至約90％融合時(shí)，按1∶2比例傳代。連續(xù)觀察P0、P1、P2、P3代MSC生長(zhǎng)情況、形態(tài)變化。2.GFP小鼠HSC的分離、鑒定：通過(guò)密度梯度離心，獲得稀釋液層下的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，MACS-CD117+磁珠分選HSC。應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(FACS)檢測(cè)CD117陽(yáng)性細(xì)胞的純度。3.間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖的研究：設(shè)置對(duì)照組：HSC組（24孔板內(nèi)單獨(dú)接種

3、造血干細(xì)胞）、MSC組（24孔板內(nèi)單獨(dú)接種間充質(zhì)干細(xì)胞）;實(shí)驗(yàn)組：Transwell共培養(yǎng)組（24孔板對(duì)應(yīng)規(guī)格Transwell內(nèi)單獨(dú)接種造血干細(xì)于上室、間充質(zhì)干細(xì)胞于下室）、2D接觸共培養(yǎng)組（24孔板共同接種造血干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞）。體外培養(yǎng)7天，觀察HSC生長(zhǎng)情況、形態(tài)變化、進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、并繪制生長(zhǎng)曲線、Cell Counting Kit（CCK-8）法測(cè)定HSC擴(kuò)增情況。測(cè)定各個(gè)組MSC細(xì)胞數(shù)量，ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中SD

4、F-1及VFGF的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.C57BL/6小鼠的MSC的分離培養(yǎng)：倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)5天開始出現(xiàn)梭形貼壁細(xì)胞，約第12天梭形細(xì)胞融合度可達(dá)90％-95％。傳代后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)較快，多在24h內(nèi)貼壁。傳至第3代后6-7天可生長(zhǎng)達(dá)80％融合并呈長(zhǎng)梭形密集排列。間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)傳代后的細(xì)胞純度逐漸升高。2.GFP小鼠的HSC的分離鑒定：實(shí)驗(yàn)中平均每只GFP小鼠的骨髓細(xì)胞液經(jīng)密度梯度離心后可以獲得約5.5×107個(gè)單個(gè)核

5、細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活性細(xì)胞率為97％。MNC經(jīng)MACS CD117磁珠分選后，平均可以獲得約1.3×105個(gè)CD117+細(xì)胞，活細(xì)胞率為98％。骨髓MNC中CD117+細(xì)胞含量約0.24％。熒光顯微鏡下可見HSC呈圓形，并可激發(fā)出綠色熒光，大小均一。流式鑒定結(jié)果顯示，磁珠分選后的CD117+HSC純度為99.51％。3.不同培養(yǎng)模式下間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞增殖的影響：①鏡下觀察MSC對(duì)HSC增殖的影響：熒光顯微鏡觀察顯示：各組HS

6、C細(xì)胞數(shù)量隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，且2D共培養(yǎng)組熒光細(xì)胞數(shù)量較其他組明顯增多;②計(jì)數(shù)法檢測(cè)MSC對(duì)HSC增殖的影響：對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行分析：共培養(yǎng)第1天，3組HSC活性細(xì)胞數(shù)量與接種時(shí)(d0)比較，HSC組（control group，單獨(dú)培養(yǎng)HSC組）與接種時(shí)比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.151）;Transwell共培養(yǎng)組與接種時(shí)比較，P=0.010;2D共培養(yǎng)組與接種時(shí)比較，P=0.002。共培養(yǎng)第1天比較3組中HSC數(shù)量，H

7、SC單獨(dú)培養(yǎng)組與Transwell組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.718);2D組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于Transwell組，P=0.0000。共培養(yǎng)第3天，3組間HSC細(xì)胞數(shù)量比較，Transwe11共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.004;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.002;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組，P=0.010。共培養(yǎng)第5天，3組間HSC細(xì)胞數(shù)量比較，Transw

8、ell共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.039;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.001;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組，P=0.000。共培養(yǎng)第7天，3組間HSC細(xì)胞數(shù)量比較，Transwell共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.001;2D共培養(yǎng)組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000;2D共培養(yǎng)組高于Transwell共培養(yǎng)組，P=0.000。③CCK-8法檢測(cè)HSC增殖：對(duì)1、3、5、7天HSC樣本進(jìn)行C

9、CK-8檢測(cè)OD值，從生長(zhǎng)曲線可以看出，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)各組HSC數(shù)量均隨之增加，第3天開始HSC細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，與MSC共培養(yǎng)對(duì)HSC增殖有促進(jìn)作用，2D共培養(yǎng)模式較Transwell共培養(yǎng)的促進(jìn)作用更明顯。共培養(yǎng)第一天，HSC單獨(dú)培養(yǎng)組與Transwell共培養(yǎng)組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.151）;HSC單獨(dú)培養(yǎng)組與2D共培養(yǎng)組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.054）。共培養(yǎng)3-7天，共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖明顯高于HSC單獨(dú)

10、培養(yǎng)組，P＜0.05;且2D共培養(yǎng)組明顯高于Transwell共培養(yǎng)組，P＜0.05。4.不同培養(yǎng)模式下，間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖可能的機(jī)制：①培養(yǎng)第7天，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中SDF-1含量，結(jié)果顯示：2D組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000;Transwell組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000;Transwell組高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于

11、Transwell組，P=0.017。②培養(yǎng)第7天，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中VEGF含量，結(jié)果顯示：2D組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.0000,Transwell組高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000,Transwell組高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組，P=0.000;2D組高于Transwell組，P=0.009。③計(jì)數(shù)法檢測(cè)共培1、3、5、7天各組MSC數(shù)量，結(jié)果顯示：MSC細(xì)胞數(shù)量

12、隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，自第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2D和Transwell共培養(yǎng)組的MSC數(shù)量均高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組，2D共培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)量高于Transwell共培養(yǎng)組，以第7天最為明顯。④對(duì)第7天HSC細(xì)胞數(shù)量、MSC細(xì)胞數(shù)量、SDF-1含量、VEGF含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：SDF-1、VEGF與HSC、MSC細(xì)胞數(shù)量間呈明顯正相關(guān)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1.與間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)的造血干細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于單獨(dú)培養(yǎng)的造

13、血干細(xì)胞，且2D接觸共培養(yǎng)的模式對(duì)造血干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用優(yōu)于非接觸共培養(yǎng)模式。2.2D接觸共培養(yǎng)模式促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖作用更強(qiáng)的機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)：①M(fèi)SC與HSC在2D接觸共培養(yǎng)模式下，分泌了更多的血管生成因子(VEGF)和趨化因子（SDF-1）。②SDF-1和VEGF的分泌具有相關(guān)性，共同促進(jìn)了HSC和MSC的增殖。③HSC對(duì)MSC增殖的具有促進(jìn)作用，MSC的增殖能力在接觸共培養(yǎng)模式下較非接觸共培養(yǎng)模式更強(qiáng)，增殖的MSC進(jìn)一步促進(jìn)