內含子miRNA反饋調節(jié)其宿主基因表達和功能的研究.pdf

1、microRNA是近年來非編碼RNA研究的熱點。miRNA是一類約22nt大小的內源RNA，它們在組織發(fā)育和細胞分化的特定階段表達，可以在轉錄后水平對許多基因的表達起著重要的調控作用，參與發(fā)育、細胞增殖、凋亡、糖代謝、應激和腫瘤的發(fā)生的生命活動。目前認為，大多數(shù)miRNA首先是通過polⅡ啟動子轉錄，產生較長的，帶有帽子結構和約80nt莖環(huán)結構的初始轉錄元(pri-miRNA)，然后通過兩種RNaseⅢ酶(Drosha和Dicer)加工

2、成為成熟的miRNA，并組裝成復合體(RISC或miRNP)。miRNA作為引導者，通過其5'端7～8 nt的種子區(qū)序列與靶基因的3’非翻譯區(qū)序列的完全互補，介導靶基因mRNA水平的降低或者抑制其蛋白的翻譯。隨著研究逐漸深入，各種miRNA的功能越來越被了解。根據miRNA在基因組中的定位將其分為兩類--基因間miRNA和內含子miRNA。內含子miRNA的研究逐漸引起人們的關注，它們來自編碼蛋白基因(宿主基因)的內含子中，大多數(shù)的內含

3、子miRNA與其宿主基因的表達具有一致性，這就提示它們之間在功能上有一定的關聯(lián)。文獻也報道有一些內含子miRNA能夠反饋調節(jié)其宿主基因的表達和功能。本研究研究的目的就是對這種反饋調節(jié)的普遍性進行進一步的探究。
　　 本研究分主要為兩部分：
　　 第一部分：A549細胞中miRNA-301反饋調節(jié)其宿主基因Ska2的表達和功能
　　 肺癌是全世界癌癥死因的第一位，而且每年死亡人數(shù)都在上升，因此肺癌成為眾多腫瘤中的研

4、究熱點。我們發(fā)現(xiàn)肺腺癌A549細胞中內含子miRNA-301表達很高，用miRNA-301特異抑制劑降低內源性miRNA-301后發(fā)現(xiàn)其宿主基因的表達下調，同時A549細胞的分裂指數(shù)增加和克隆形成能力降低，這與用siRNA敲除其宿主基因Ska2產生的效果相同，說明miRNA-301在表達和功能上反饋調節(jié)其宿主基因。為找到miRNA-301反饋調節(jié)其宿主基因的信號通路，我們首先通過生物信息學確定miRNA-301的直接靶基因--MEOX2

5、，后續(xù)的熒光素酶試驗和mRNA表達水平實驗進一步證明MEOX2是miRNA-301的靶基因。MEOX2的功能是抑制ERK信號通路。在A549細胞中由于miRNA-301的高表達導致MEOX2表達下降，進而ERK信號通路加強。ERK信號通路的加強增加其下游分子--CREB的活性。通過生物信息學和ChIP實驗證實CREB是Ska2的轉錄激活因子，CREB的活性增加從而導致上調Ska2的表達。同時還發(fā)現(xiàn)CREB還上調Ska2的相互作用蛋白Sk

6、a1，這就說明miRNA-301功能上反饋調節(jié)其宿主基因的功能。CREB是肺癌發(fā)生中重要因子，由于它的活性增加導致其下游的相關癌基因--如c-fos和egr1高表達，這可能是肺癌發(fā)生的一個重要原因。本部分的實驗結果一方面說明內含子miRNA-301在A549細胞反饋調節(jié)其宿主基因Ska2，另一方面為肺癌的發(fā)生提供一種可能的機制。
　　 第二部分：內含子miRNA反饋調節(jié)其宿主基因表達現(xiàn)象的普遍性研究
　　 我們第一部分的

7、研究和已發(fā)表文獻表明這種反饋調節(jié)可能有一定的普遍性。直接驗證內含子miRNA對其宿主基因功能上的反饋調節(jié)有難度，所以我們先從其對宿主基因表達上的反饋調節(jié)入手。為驗證這種普遍性，我們我們從Sanger數(shù)據庫將所有的miRNA下載，從中找出高度保守的內含子miRNA(大約65個)，再參考ambion的miRNA在常見癌細胞中表達譜，從中再找出在我們所選的五個細胞系(HeLa、HepG2、A549、MCF-7、T24)中大部分較高表達的10個

8、miRNA，分別是miR-26a/93/107/140-5p/191/153-1/196b/208a/218-1/338-5p。根據它們的序列合成它們的抑制(二氧甲基化的反義寡核苷酸)。然后將這些抑制劑分別轉染上述五種細胞中，48小時后提總RNA，反轉錄，通過實時定量PCR檢測它們宿主基因的表達變化。實驗的結果表達大部分的miRNA會對其宿主基因的表達產生反饋調節(jié)，同時我們也發(fā)現(xiàn)在不同的細胞系中這種反饋調節(jié)的方向不同，譬如說miRNA-