核素報告基因顯像監(jiān)測轉基因骨髓間充干細胞移植治療的基礎研究.pdf

1、目的
　　 構建攜帶HSV1-TK和BDNF的重組真核質粒表達載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF和重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP，分別將其轉染體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs，探討不同載體對BMSCs的轉染效率、轉染細胞的增殖能力和向神經元樣細胞誘導分化能力、兩目的基因的表達相關性，以及轉染報告基因（HSV1-TK）的BMSCs對131I-FIAU的體外攝取。為下一步選擇合適的載體活體監(jiān)測轉基因BM

2、SCs治療腦梗死提供實驗基礎。
　　 方法
　　 1.不同重組載體的構建和 SD大鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定
　　 1.1．重組真核質粒表達載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的構建及鑒定
　　 根據Gene bank上的CDs區(qū)，設計并合成HSV1-TK、IRES、BDNF的全長擴增引物，并在引物兩端加入與真核質粒表達載體pcDNA3.1+的多克隆位點（multiple cloning site

3、s，MCS）相對應的酶切位點。應用聚合酶聯(lián)反應（polymerase chain reaction, PCR）技術分別從重組質粒pcDNA3.1-TK、pIRES-EGFP中擴增獲得TK和IRES的cDNA序列；用RT-PCR技術從1周齡SD大鼠腦組織中提取、擴增BDNF的cDNA序列。對上述目的基因全長片段進行雙酶切后，依次插入到經過相對應酶切的質粒載體pcDNA3.1+的MSC中，每一步得到的重組質粒均經過酶切鑒定，最后進行序列分析

4、。
　　 1.2．重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的構建及鑒定
　　 以含巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）啟動子的表達質粒pDC316-EGFP為載體，將偶聯(lián)基因TK-IRES-BDNF插入MCS，構建重組腺病毒表達質粒載體pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP。以pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP為重組表達質粒，與重組腺病毒（Adenovirus,

5、Ad）骨架質粒共轉染293T細胞，包裝生成腺病毒重組體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP，以Ad5-EGFP為對照病毒。本研究部分與上海鳴宏生物有限公司合作完成。
　　 1.3．SD大鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定
　　 分離4～6周健康SD大鼠股骨和脛骨，用含15％胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基沖出骨髓液，密度梯度離心后，接種于塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)出的BMSCs連續(xù)傳3～4代，細胞純化后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并

6、通過免疫細胞化學檢測表面抗原CD44和CD34的表達。
　　 2.不同載體轉染BMSCs的實驗研究
　　 2.1．不同載體對BMSCs轉染效率的測定
　　 在相同轉染條件下，用脂質體介導重組真核質粒表達載體pcDNA3.1-EGFP轉染BMSCs，在綠色熒光顯微鏡下觀察增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorenscent protein, EGFP）的表達時間和表達陽性率，間接反映脂質體介導重

7、組質粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF對BMSCs的轉染效率和表達時間。重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP在不同轉染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)下轉染BMSCs，熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達時間和表達陽性率。
　　 2.2．不同載體轉染BMSCs后細胞增殖能力、向神經元樣細胞分化能力的檢測
　　 不同重組基因載體轉染BMSCs后，在不同時間內，

8、倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和密度變化，MTT比色法檢測轉染細胞的增殖能力。對轉染重組腺病毒的BMSCs加入堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和表皮生長因子（epidermAlgrowth factor, EGF），不同時間下在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，檢測轉染細胞向神經元樣細胞的分化能力。
　　 2.3.不同載體轉染BMSCs后目的基因表達的檢測
　　 重

9、組質粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉染BMSCs后用RT-PCR檢測TK基因的轉錄，Western blot檢測BDNF蛋白的表達；不同MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs后，實時定量聚合酶聯(lián)反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)和2－△△CT方法分析兩目的基因HSV1-TK與BDNF的相對表達量（C

10、T），并進行相關性分析；Western blot檢測并分析HSV1-TK與BDNF的蛋白水平表達。
　　 3．131I-FIAU的標記及BMSCs轉染不同載體后對131I-FIAU的攝取
　　 3.1. 131I-FIAU的標記及質量鑒定
　　 利用Iodogen固相氧化法對FAU進行放射性碘標記，標記產物用Sep-Pak-C-18反相層析色譜小柱進行純化及標記率分析，TLC-SG硅膠板薄層層析法測定標記產物的放

11、射化學純度，并觀察131I-FIAU在37℃正常人新鮮血清中放置4h、12h和24h后的體外穩(wěn)定性。
　　 3.2.不同載體轉染BMSCs后對131I-FIAU的攝取研究
　　 不同載體轉染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU，在不同時間分別計數(shù)細胞培養(yǎng)基上清液中的放射性計數(shù)和消化后細胞的放射性計數(shù)，細胞攝取結果為：攝取率=C細胞懸液/（C細胞懸液+C細胞培養(yǎng)基）×100％。
　　 第一組實驗，重

12、組真核質粒表達載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU。在一定觀察時間內，分析轉染重組質粒的BMSCs對131I-FIAU的攝取數(shù)值隨時間的變化，以轉染質粒pcDNA3.1+為對照組。
　　 第二組實驗，在MOI分別為0、50、100、150、200、250轉染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU。在相同時間下分析不同MOI的重組腺病毒載體Ad5-TK

13、-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs對131I-FIAU的攝取研究。
　　 第三組實驗，結合上述實驗不同MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP對BMSCs的轉染效率，MTT對增殖能力的分析結果，不同MOI的重組腺病毒在相同時間下對131I-FIAU的攝取結果。以最佳MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs，分析轉染重組腺病毒的BMSCs對131I-FIAU的攝取數(shù)值

14、隨時間變化的關系，以轉染無效病毒Ad5-EGFP為對照組。
　　 4.統(tǒng)計學方法數(shù)據分析
　　 采用SPSS11.0軟件進行，線性相關采用Pearson分析，兩樣本均數(shù)比較采用雙側t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1.不同重組載體的構建和SD大鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定
　　 1.1．重組真核質粒表達載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的構建及鑒定
　　 重

15、組真核質粒表達載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF經PCR、酶切和序列分析鑒定與預期設計一致。
　　 1.2．重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的構建及鑒定
　　 由上海鳴鴻生物有限公司協(xié)作構建的重組表達質粒pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP經PCR、酶切鑒定和測序鑒定與預期設計一致；包裝生成的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的活病毒數(shù)量達到2.0×101

16、0PFU（plaque formation unit）/ml，對照重組腺病毒Ad5-EGFP的活病毒數(shù)量為3.6×1010PFU/ml。
　　 1.3．大鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定
　　 采用密度梯度離心法獲得到的BMSCs傳到3～4代后，可獲得較高純度和保持良好的增殖能力；細胞免疫化學鑒定，CD44在95％以上的BMSCs表面表達，而CD34則未見明顯表達。
　　 2．不同載體轉染體外培養(yǎng)的BMSCs實驗研究

17、r>　　 2.1．不同載體對BMSCs轉染效率的測定
　　 以陽離子脂質體（μl）與重組質粒載體（μg）pcDNA3.1-EGFP在2.5：1時轉染BMSCs，48h時EGFP有較高表達效率，在隨后的觀察時間內EGFP的表達開始下降；不同MOI的重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs后，綠色熒光顯微鏡下觀察，在24h開始表達EGFP，48h達到高峰，120h開始下降；MOI為150時在轉染效率可

18、大于90％。
　　 2.2．不同載體轉染BMSC后細胞增殖能力、向神經元樣細胞分化能力的檢測
　　 不同載體轉染BMSCs后，在一定時間內于倒置顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)重組質粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉染BMSCs后細胞密度明顯減低，有較多細胞漂浮，臺盤蘭染色證實為死亡細胞。而重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的MOI為250時轉染BMSCs后，在觀察時間內細胞形態(tài)和密度均無明顯變化，細

19、胞培養(yǎng)基中僅可見極個別漂浮細胞。MTT比色法亦證實重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP對BMSCs的毒性作用較小， MOI在150時細胞存活率仍大于98％。重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs的同時在細胞培養(yǎng)基中加入bFGF和EGF，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)轉染重組腺病毒組和未轉染重組腺病毒組的BMSCs均保持向神經元樣細胞的良好分化能力，兩組相比無明顯差別。
　　

20、 2.3．不同載體轉染BMSCs目的基因表達的檢測
　　 重組真核質粒表達載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉染BMSCs 48h后，通過RT-PCR技術可檢測到HSV1-TK的表達，Western blot檢測到BDNF的表達。不同MOI的重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs后，通過RQ-PCR檢測到兩目的基因的表達，并且隨著病毒MOI的增加表達增強。HSV1-TK和BNDF兩目的

21、基因的表達有良好的線性相關（r=0.973，p＜0.05, n=3）。Western blot亦檢測到了HSV1-TK和BNDF兩目的基因的表達，隨著病毒MOI的增加，基因表達也在增加。
　　 3．131I-FIAU的標記及不同載體轉染BMSCs后對131I-FIAU的攝取研究
　　 3.1. 131I-FIAU的標記及質量鑒定
　　 Iodogen固相氧化法能有效標記FAU；經測定，標記物的標記率為(64.35

22、±4.89)％（n=5）。TLC-SG硅膠板層析法測定，131I-FIAU的放射化學純度為(98.62±0.62)％（n=5）。131I-FIAU在正常人血清中37℃中孵育24 h后，放射化學純度仍大于95％。
　　 3.2.不同載體轉染BMSCs后對131I-FIAU的細胞攝取研究
　　 第一組實驗，重組質粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉染BMSCs后對131I-FIAU的攝取研究，以轉染質粒pcDN

23、A3.1+為對照組。
　　 重組質粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU，分析5h內對131I-FIAU的攝取。研究發(fā)現(xiàn)在前3h隨著時間的延長攝取增加，在3h對131I-FIAU的攝取達到平臺期，值為（4.15±0.074）％，n=3，在隨后的觀察時間內攝取數(shù)值增加不明顯。在各個觀察時間點轉染目的質粒組與對照質粒組對131I-FIAU的攝取數(shù)值相比，有統(tǒng)計學意義（

24、t=9.29～232.75，p＜0.05，n=3）。
　　 第二組實驗，MOI分別為0、50、100、150、200、250的重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs后，分析相同時間對131I-FIAU的細胞攝取。
　　 不同MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs 48h后，在同一時間點3h時分析轉染細胞對131I-FIAU的攝取。研究發(fā)現(xiàn)重組腺病毒隨著M

25、OI的增加對131I-FIAU的攝取增加，在MOI為150時達到平臺期，隨后隨著MOI的增加轉染重組腺病毒的BMSCs對131I-FIAU攝取增加不明顯。
　　 第三組實驗中，相同MOI重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉染BMSCs后，分析轉染BMSCs不同時間對131I-FIAU的攝研究，以轉染對照病毒Ad5-EGFP為對照組。
　　 結合上述轉染效率、MTT等實驗結果，確定重組腺病毒載體Ad5

26、-TK-IRES-BDNF-EGFP的MOI為150時是對BMSCs最佳轉染效率。MOI為150轉染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU，分析不同時間轉染重組腺病毒的BMSCs對 131I-FIAU的攝取研究。結果發(fā)現(xiàn)在前3h內，轉染了重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的BMSCs隨著時間的延長，其攝取131I-FIAU也在增加，在3h攝取數(shù)值可達（31.42±0.46）％（n=3），此后隨著時間的延長

27、，攝取數(shù)值增加不明顯。在觀察時間內各時間點轉染重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的BMSCs對131I-FIAU的攝取均顯著高于對照組，兩組相比具有統(tǒng)計學意義（t=23.06-173.83，P＜0.05，n=3）。
　　 結論
　　 本研究通過體外比較攜帶報告基因HSV1-TK和治療基因BDNF的不同載體轉染BMSCs實驗研究，證實重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP是一種可以攜

28、帶較大容量堿基，對BMSCs有較高轉染效率，轉染重組腺病毒后的BMSCs仍保持良好的增殖能力和向神經元樣細胞誘導分化能力，IRES介導上游報告基因的表達可間接反映下游治療基因的表達，二者具有良好的線性相關。利用Indogen固相氧化法對FAU進行放射性核素131I標記，標記產物用Sep-Pak-C-18反相層析色譜小柱進行純化，是一種簡單的標記及純化技術，可得到較高的放射化學純度。重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP

29、轉染BMSCs可表達有活性的HSV1-TK，能有效介導BMSCs攝取131I-FIAU，在一定的MOI范圍內其攝取數(shù)值隨著MOI的增加而增加，有明顯的劑量依賴性；此外，在一定的觀察時間內隨著時間的延長，對131I-FIAU的攝取數(shù)值亦在增加，顯著高于對照組。本研究為后續(xù)以重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP為載體介導的放射性核素報告基因活體監(jiān)測蹤轉基因BMSCs治療腦梗死的干細胞有效歸巢數(shù)量、分化和功能表達過程，以及對外