多靶點(diǎn)抗原肽自體免疫細(xì)胞治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌的免疫應(yīng)答研究及聯(lián)合TACE的臨床療效.pdf

1、研究目的：
　　腫瘤的細(xì)胞治療屬于腫瘤生物治療范疇，旨在通過(guò)應(yīng)用免疫學(xué)原理和方法，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)從而達(dá)到治療腫瘤的目的。按照不同機(jī)制可分為主動(dòng)性和過(guò)繼性免疫治療兩大類(lèi)，被認(rèn)為是繼手術(shù)、放化療之后的又一腫瘤綜合治療方法。原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是指發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，主要包括原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(Intr

2、ahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝細(xì)胞癌-肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌混合型等不同病理類(lèi)型，其中HCC約占原發(fā)性肝癌的90％。HCC是我國(guó)發(fā)生率最高的惡性腫瘤之一，惡性程度較高，發(fā)病一般非常隱匿，確診時(shí)大多數(shù)患者已達(dá)BCLC中晚期，從而失去了根治性治療的機(jī)會(huì)，預(yù)后較差。因此HCC的免疫治療已成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。本研究采用多靶點(diǎn)抗原肽自體免疫細(xì)胞治療技術(shù)（multiple antigen stimulating ce

3、llular therapy，MASCT）誘導(dǎo)成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，將成熟DC和CTL回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，旨在探索MASCT治療HCC誘導(dǎo)患者體內(nèi)免疫應(yīng)答研究及聯(lián)合TACE的臨床療效。
　　研究方法：
　　1.MASCT誘導(dǎo)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)免疫應(yīng)答研究
　　分離HCC患者PBMC，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)分化為非成熟DC，并負(fù)

4、載14種抗原肽，加入促成熟因子培養(yǎng)分化為抗原提呈的成熟DC，成熟DC與非貼壁細(xì)胞共培養(yǎng)，分化形成抗原特異性CTL。用免疫熒光的方法分析抗原肽是否能被DC內(nèi)化以及進(jìn)入胞內(nèi)的分布情況，并對(duì)回輸?shù)腄C及CTL進(jìn)行細(xì)胞表型及細(xì)胞因子檢測(cè)。用HLA-A2+患者CTL和HCC細(xì)胞系HepG2細(xì)胞(HLA-A2+)、HuH-7細(xì)胞(HLA-A2-)分別作為效靶細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，分析CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的HLA限制性。
　　前瞻性納入13例

5、HCC根治術(shù)后患者，每個(gè)患者預(yù)計(jì)接受3個(gè)療程MASCT治療，治療期間按時(shí)隨訪，患者被診斷腫瘤進(jìn)展，立即終止研究，轉(zhuǎn)為傳統(tǒng)治療?；颊唠S訪期間，采集患者PBMC，分析治療前后體內(nèi)免疫應(yīng)答情況，分別進(jìn)行(1).T細(xì)胞亞群檢測(cè);(2).抗原特異性T細(xì)胞增殖（Edu染色）及IFN-γ水平測(cè)定;(3).各抗原單肽特異性免疫應(yīng)答檢測(cè)。
　　2.MASCT聯(lián)合TACE治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床療效研究
　　回顧性分析2010-15年南方醫(yī)院肝

6、病中心收治的66例接受TACE治療的HCC患者，按是否聯(lián)合MASCT治療分為聯(lián)合治療組（32例）和單純TACE組（34例），單純TACE組采用TACE治療，聯(lián)合治療組在TACE間歇期進(jìn)行MASCT治療。主要觀察指標(biāo)為兩組患者的無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期(OS)。探索聯(lián)合MASCT治療能否提高TACE的療效，延長(zhǎng)PFS和OS。
　　研究結(jié)果：
　　1.MASCT成功誘導(dǎo)培養(yǎng)mDC和CTL，多次治療后可改善HCC患者體內(nèi)免

7、疫抑制狀況，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答
　　經(jīng)過(guò)上述MASCT細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，患者每次接受皮下注射的DC平均2.23×107，這些細(xì)胞高表達(dá)DC成熟信號(hào)分子，表現(xiàn)出完整的免疫功能性質(zhì)。此外，這些DC分泌高水平促炎因子IL12，低水平免疫抑制因子IL10。免疫熒光試驗(yàn)顯示，抗原長(zhǎng)肽能有效地被imDC內(nèi)化，主要定位于細(xì)胞質(zhì)而非溶酶體?；颊呙看谓邮芑剌?shù)腃TL平均6.63×109，這些細(xì)胞幾乎全是CD3+T細(xì)胞，大部分為CD8+T細(xì)胞，小部分為C

8、D4+和CD3+CD56+(NKT)細(xì)胞，極少量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。此外CTL上清中檢測(cè)到一定量的IFN-γ和TNF-α，極少量免疫抑制因子IL10和II4。產(chǎn)生于HLA-A2+患者的CTL對(duì)HepG2細(xì)胞(HLA-A2+)表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷活性相對(duì)于HuH-7細(xì)胞（HLA-A2-）。
　　MASCT治療后患者不良反應(yīng)少，多次MASCT治療后，患者外周血NKT細(xì)胞，CD56+NKG2D+細(xì)胞，和效應(yīng)T細(xì)胞比例上調(diào)，Tre

9、g細(xì)胞比例持續(xù)下調(diào)。此外，T細(xì)胞特異性增殖及分泌IFN-γ的能力均顯著提高，T細(xì)胞對(duì)HCC抗原肽庫(kù)及多種抗原單肽產(chǎn)生了特異性免疫應(yīng)答，且未復(fù)發(fā)患者PBMC的特異性免疫應(yīng)答水平顯著高于復(fù)發(fā)患者。
　　2.MASCT治療可以顯著提高TACE的療效，延長(zhǎng)PFS和OS。
　　聯(lián)合治療組和單純TACE組中位PFS分別為9.5個(gè)月和5.5個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.001);聯(lián)合治療組和單純TACE組中位OS分別為19.5個(gè)月和10

10、.5個(gè)月，兩組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.033)。是否接受MASCT治療、治療前AFP水平、門(mén)靜脈侵犯、ECOG評(píng)分是影響HCC患者PFS的獨(dú)立預(yù)后因素;而是否接受MASCT治療、治療前總膽紅素水平、門(mén)靜脈侵犯是影響OS的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　研究結(jié)論：
　　1.本研究表明MASCT技術(shù)可成功誘導(dǎo)培養(yǎng)mDC及CTL，并可改善HCC患者體內(nèi)免疫抑制狀態(tài)，誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤抗原肽的特異性免疫應(yīng)答，且會(huì)隨著治療次數(shù)的增加而增強(qiáng)應(yīng)答。