十字花科黑腐病菌全局調(diào)控蛋白RsmAxcc直接調(diào)控靶標的鑒定.pdf

1、Csr(Carbon Storage Regulator)/Rsm(Repressor of Secondary Metabolism)全局調(diào)控系統(tǒng)是一個由CsrA/RsmA蛋白和CsrB/RsmB，CsrC/RsmC等非編碼RNA(noncoding RNA，也稱small RNA)以及受CsrA/RsmA蛋白直接調(diào)控的mRNA組成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)廣泛分布在各種細菌中，在細菌的碳代謝、次生代謝、運動性、生物膜形成以及一些病原菌

2、的致病過程中發(fā)揮非常重要的作用。其調(diào)控機制在大腸桿菌(Escherichia coli)中研究得比較透徹。CsrA/RsmA蛋白是一類RNA結(jié)合蛋白，也是一個轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子，它通過與靶標基因mRNA的特異性結(jié)合影響基因的翻譯，同時它還是一個全局調(diào)控子，它參與各種與致病相關(guān)的許多細胞過程。在十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathvar campestris，簡稱Xcc）中，CsrA/RsmA稱為RsmAxc

3、。小RNA是轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控的主要參與者，它通過與CsrA/RsmA的結(jié)合調(diào)節(jié)CsrA/RsmA的活性。
　　 目前，已經(jīng)證實了在十字花科黑腐病菌中RsmAxc參與包括致病在內(nèi)的多種細胞過程，但Xcc中Rsm全局調(diào)控系統(tǒng)的另兩個重要組分——小RNA和mRNA——尚不清楚，為了深入了解RsmAxcc的作用機制，必須在Xcc中分離鑒定出與RsmAxc相互作用的小RNA和mRNA。
　　 本研究先采用共純化法鑒定Xcc8004中

4、與RsmAxc互作的小RNA和mRNA。在采取共純化方法獲取靶標的時候，我們構(gòu)建出了能過量表達6×His RsmAxcc蛋白的黃單胞菌菌株。為了證明表達的蛋白具有生物學活性，我們將表達蛋白的融和質(zhì)粒導入到rsmAxc缺失突變體菌株DM2506中，通過表型檢測分析，我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的導入使得DM2506缺失的表型得到回補。這說明我們說獲得的6×His RsmAxc蛋白是有生物學活性的蛋白，可以用于下游的靶標鑒定實驗中。在本實驗中，我們共得到7

5、68個克隆，從中挑選出180個送測序公司測序，測序后得到168條序列，經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)有15條序列能與Xcc 8004全基因組比對上，其中有5條是編碼23S核糖體RNA的基因，有10條是編碼tRNA的基因。結(jié)果表明，通過該方法，我們沒有鑒定出Rsm全局調(diào)控系統(tǒng)中的sRNA和mRNA。
　　 另外，本研究還采用了靶標預測的方法鑒定RsmAxc的直接作用靶標。在十字花科黑腐病菌Xcc8004中，RsmAxc蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平上直接調(diào)控

6、著很多編碼含有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的基因。基于這一猜想，我們挑選出6個編碼含有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的基因：XC_0831、XC_1036、XC_1383、XC_1411、XC_2228、XC_2324作為受RsmAxc直接調(diào)控的候選靶標。經(jīng)過電泳遷移率變動實驗(electrophoresis mobility shif assay, EMSA)，我們初步確定出基因XC_2228可能在轉(zhuǎn)錄后水平上受RsmAxc蛋白的直接調(diào)