TLR4‐Src調(diào)控巨噬細胞脂質(zhì)累積的研究.pdf

1、【目的】
　　動脈粥樣硬化是導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要病理基礎(chǔ)，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）在巨噬細胞內(nèi)的沉積，通過引起并增強局部慢性炎癥，加速動脈粥樣硬化過程，而局部慢性炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)病機制的基礎(chǔ)。我們及其他實驗室已經(jīng)論證 toll樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）在巨噬細胞的脂質(zhì)累積及炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。TLR4

2、首度被發(fā)現(xiàn)是通過識別脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）和活化包含 Src激酶的下游信號，在固有免疫發(fā)揮了重要的作用。作為一種非受體酪氨酸激酶，Src被認為和多種信號通路和細胞過程有關(guān)。作為多種內(nèi)源性、外源性刺激的“整合因子”，調(diào)控巨噬細胞的生長，遷移，黏附，及脂質(zhì)代謝過程。本研究中，通過利用oxLDL刺激巨噬細胞體外模擬動脈粥樣硬化過程，探討TLR4-Src信號傳導(dǎo)通路在oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞吞脂及炎癥過程中所發(fā)

3、揮的調(diào)控作用。
　　【方法】
　?。?）收集人粥樣硬化病變的股動脈以及作為正常對照的乳內(nèi)動脈標本，提取組織蛋白，用western-blot檢測組織樣品中Src激活情況。
　?。?）體外培養(yǎng)人原代巨噬細胞及Raw264.7巨噬細胞系，給予oxLDL刺激誘導(dǎo)，，研究人動脈粥樣硬化斑塊組織中Src激活的增加與oxLDL的關(guān)系。
　?。?）分別使用Src特異性siRNA轉(zhuǎn)染，及PP2(10μM)或 PP3(10μM)預(yù)處

4、理Raw264.7細胞30分鐘后（PP3作為PP2的陰性對照），再加入oxLDL（50ug/mL）刺激細胞24小時。通過分別抑制Src蛋白表達或者激活以觀察Src對于巨噬細胞脂質(zhì)累積的影響。
　　（4）導(dǎo)入Src siRNA或TLR4 siRNA以敲減巨噬細胞TLR4或者Src蛋白表達水平，用oxLDL（50ug/ml）刺激細胞24h，檢測細胞內(nèi)CD36及LOX-1的蛋白表達，檢測TLR4/Src經(jīng)由哪種受體調(diào)控細胞脂質(zhì)累積。

5、r>　　（5）以上述方抑制Src表達水平和活性之后，使用oxLDL刺激細胞24h，檢測細胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子IL6、IL8、MCP-1和MMP-2的含量。
　?。?）收集人粥樣硬化病變的股動脈以及作為正常對照的乳內(nèi)動脈標本，HE染色及免疫組化分析，檢測動脈粥樣斑塊組織中 CD68、TLR4、Src表達水平；對動脈粥樣硬化斑塊組織進行免疫熒光染色，檢測動脈粥樣斑塊組織中CD68、TLR4、Src的表達定位。
　　（7）TLR

6、4特異性siRNA導(dǎo)入RAW264.7細胞中，并以導(dǎo)入陰性對照（NC）為參照，轉(zhuǎn)染48小時后 oxLDL（50ug/ml）刺激1小時，檢測Src激活情況。
　?。?）oxLDL（50ug/ml）刺激Raw264.7細胞0，15，30，60分鐘，采用免疫共沉淀法，檢測TLR4與Src在體外的結(jié)合情況。
　?。?）將TLR4特異性siRNA導(dǎo)入Raw264.7細胞系后，oxLDL（50ug/ml）刺激細胞60分鐘后，通過細胞免疫

7、熒光法，檢測細胞Src、TLR4的表達水平，并進行共定位。
　?。?0）導(dǎo)入TRAF6 siRNA以降低TRAF6的表達水平48h，oxLDL（50ug/ml）刺激60分鐘，進一步通過免疫共沉淀法，檢測TLR4和Src的結(jié)合水平。（11）oxLDL（50ug/ml）刺激巨噬細胞60分鐘，采用免疫共沉淀法檢測TLR4與Fyn及Lyn的結(jié)合情況。
　　【結(jié)果】
　?。?）與人動脈正常組織相比較，粥樣硬化病變組織中Src激活

8、顯著性增加。
　?。?）oxLDL刺激巨噬細胞后，Src的表達活性增加，并呈時間和劑量依賴性。
　?。?）抑制了Src表達和激活后，oxLDL所誘導(dǎo)的巨噬細胞的吞脂反應(yīng)顯著下降。
　　（4）抑制細胞內(nèi)Src及TLR4表達水平后，oxLDL誘導(dǎo)的CD36表達水平下降。
　?。?）抑制細胞內(nèi)Src表達水平及活性后，炎癥因子IL6、IL8、MCP-1和MMP-2的分泌量下降。
　?。?）相較于正常乳內(nèi)動脈組織，發(fā)

9、生動脈粥樣硬化病變的股動脈組織中，巨噬細胞（CD68陽性細胞）高富集于動脈粥樣硬化斑塊脂核區(qū)，且巨噬細胞中TLR4表達量及Src激酶酪氨酸418位點活化均升高，免疫熒光結(jié)果示Src與TLR4共定位于CD68陽性細胞中。
　?。?）與oxLDL（-）組相比，oxLDL刺激巨噬細胞后，其Src激酶磷酸化顯著升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（**P<0.01）。當TLR4表達下調(diào)時（TLR4特異性siRNA組），oxLDL誘導(dǎo)Src激酶磷酸化能

10、力顯著性受到抑制，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（## P<0.01）。
　　（8）oxLDL刺激Raw264.7細胞30和60分鐘組，TLR4和Src能夠相互作用并結(jié)合在一起。
　?。?）oxLDL刺激后，細胞膜表面可見紅色TLR4及綠色Src免疫染色，證實細胞膜表面有TLR4及Src表達。融合照片可見，TLR4和Src共定位于RAW264.7細胞膜表面，黃色區(qū)域為融合區(qū)域。且TLR4特異性siRNA處理組，可見其Src表達水平明顯下

11、降。
　?。?0）TRAF6敲減后，TLR4與Src結(jié)合無明顯變化。
　?。?1）oxLDL（50ug/ml）刺激巨噬細胞60分鐘后，Src家族成員Fyn及Lyn未見與TLR4結(jié)合
　　【結(jié)論】
　　oxLDL通過TLR4介導(dǎo)，誘導(dǎo)Src表達激活升高，并促進TLR4/Src復(fù)合體形成，調(diào)控巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)累積及炎癥反應(yīng)過程，從而參與到動脈粥樣硬化的進程中。而此過程與巨噬細胞膜表面清道夫受體CD36表達水平有關(guān)，但不