菜用大豆轉錄因子GmPLZ及其互作蛋白的研究和菜豆ANK家族基因的鑒定.pdf

1、在農作物的生長過程中，環(huán)境對其產生相應的影響，尤其是非生物脅迫嚴重造成了品質以及產量上不可估量的損失。因此針對作物的抗逆方面的機制以及挖掘抗逆相關的功能基因對增強和提高作物的抵抗逆特性境的性具有重要的意義，一些蛋白激酶、磷脂結合蛋白及轉錄因子均能在抵抗植物的逆境方面發(fā)揮著異常重要的作用。本文通過對過表達GmPLZ擬南芥的表型鑒定，發(fā)現GmPLZ轉錄因子在非干旱和高鹽脅迫下發(fā)揮重要作用，并通過對其抗逆機制的研究，篩選出與其互作的兩個候選蛋

2、白GmPAK蛋白激酶和GmCap磷脂結合蛋白。通過酵母雙雜交技術，驗證了候選蛋白與GmPLZ轉錄因子之間的互作關系；另外利用綠色熒光GFP融合蛋白表達載體和實時熒光定量RT-PCR技術，對兩個候選蛋白GmPAK蛋白激酶和GmCap磷脂結合蛋白的分子特征進行了描述，并闡述了GmPLZ轉錄因子在參與并提高植物對種種抗逆性方面的相對分子機制。通過對菜豆ANK家族基因的生物信息學、分子特征以及表達模式分析，發(fā)現ANK蛋白同樣在植物抵抗非生物脅迫

3、中扮演著重要的作用，結果如下：
　　1. GmPLZ基因的抗逆性分析。通過RT-PCR分析GmPLZ基因在干旱和鹽處理條件下呈現出來的上調表達，在干旱2h時表達量達到最高；在鹽脅迫條件下，24h時表達量體現出來的是達到最高。通過對GmPLZ過表達擬南芥的表型分析進一步證明，該基因在抵抗干旱和高鹽脅迫中具有重要的作用。
　　2. GmPLZ互作蛋白的篩選。利用酵母雙雜交技術，構建GmPLZ-pGBKT7誘餌表達載體，對與之相關

4、的旱、鹽脅迫的大豆cDNA文庫篩選，通過對篩選結果的測序以及GenBank數據庫比對分析，發(fā)現其候選蛋白主要參與植物逆境脅迫響應、生長發(fā)育和能量代謝等活動，通過進一步的研究并同時篩選出兩個與其相互之間產生作用的蛋白：GmPAK蛋白激酶和GmCap磷脂結合蛋白。
　　3.驗證 GmPLZ與 GmPAK和 GmCap的互作。本文通過構建 GmPAK-pGADT7和GmCap-pGADT7表達載體，并將其分別地共轉化酵母感受態(tài)細胞，通過

5、雙雜驗證與誘餌蛋白彼此之間的關系和作用，結果體現的是，在酵母體內GmPLZ與GmCap、GmPAK確實存在彼此之間互作的關系，結果暗示GmPLZ在植物抵抗各種非生物脅迫的響應中具有相當重要的意義。
　　4. GmPAK和GmCap蛋白的分子特征及表達模式分析。通過構建綠色熒光GFP融合表達載體GmPAK-GFP和GmCap-GFP，并將其分別轉入擬南芥原生質體細胞，發(fā)現GmPAK和GmCap蛋白都具有膜定位特征；通過磷酸化特異抗體

6、鑒定融合蛋白TF-His-GmPAK的自磷酸化活性。通過Real-time PCR分析，發(fā)現GmPAK基因在干旱缺水的脅迫條件下，上調趨勢表達，并在24h時達到了最高值；在高溫條件下，2h時達到最高的表達值；在NaCl和BR的處理條件下，各個時間段下沒有明顯的改變。該結果說明GmPAK基因受干旱缺水的調控。GmCap基因在干旱處理1h后表達量明顯趨于最大；但在高溫、NaCl以及BR脅迫下，表達量并沒有相對顯著的改變。這些結果說明GmCa

7、p基因在干旱的條件下變化是明顯的，受到干旱的脅迫表達。
　　5.菜豆ANK家族基因的系統(tǒng)分析。菜豆基因組中一共含有30個ANK家族基因，在所有的9條染色體上均有不同程度的分布，位于在第5條染色體上含有最多的數量即13個ANK基因。通過對分析發(fā)現，ANK25基因不僅僅含有ANK結構域，同時還含有一個RING結構域。亞細胞定位結果顯示，ANK25主要定位在細胞膜上。通過RT-PCR分析發(fā)現，ANK25在干旱、鹽和ABA脅迫下均有響應。