內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎?。―N）是全球范圍內(nèi)引起終末期腎病(ESRD)的主要原因之一。蛋白尿是DN的首要臨床特征，也是判斷DN嚴(yán)重程度的指標(biāo)，同時(shí)蛋白尿又是DN進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。我們推測(cè)ERS參與AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡可能是由AOPPs與RAGE結(jié)合后通過NADPH氧化酶依賴的ROS生成所介導(dǎo)的。
　　目的：
　　旨在通過體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞證實(shí)我們上述假設(shè)，并進(jìn)一步闡明AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。
　　方法：

2、>　　1.AOPPs修飾的小鼠白蛋白(AOPPs-MSA)的制備和鑒定
　　AOPPs-MSA的制備和鑒定參考文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)所介紹的方法。將MSA溶液與濃度為200mmol/L的次氯酸以1/140的摩爾比例混合，室溫反應(yīng)30分鐘(25～30℃);然后將制備的樣品在4℃無菌PBS中透析24h，以去除殘留的游離次氯酸。未經(jīng)修飾的MSA與PBS等體積混合，作為對(duì)照。制備的所有AOPPs-MSA經(jīng)Detoxi-Gel凝膠柱去除所含的內(nèi)毒素，內(nèi)毒

3、素水平通過鱟試驗(yàn)法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，所制備的溶液中內(nèi)毒素水平低于0.025EU/ml。AOPPs含量測(cè)定:在碘化鉀存在的條件下，以不同濃度氯胺T制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定酸性條件下340nm處的吸光度值。AOPPs-MSA和未經(jīng)修飾的MSA中AOPPs的濃度分別為:70.2±3.41nmol/mg、0.23±0.05nmol/mg。在所有制備的樣品中均不能檢測(cè)到AGEs的成份。
　　2.足細(xì)胞的培養(yǎng)
　　小鼠足細(xì)胞按文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)所介

4、紹的方法培養(yǎng)。將未分化的足細(xì)胞系培養(yǎng)于含10％胎牛血清、鏈霉素(100μg/ml)、青霉素(100U/ml)、丙酮酸鈉(1mmol/L)、碳酸氫鈉(0.075％)和HEPES緩沖液(10mmol/L)的RPMI1640培養(yǎng)液中。在上述培養(yǎng)基中加入10u/ml的重組小鼠□-干擾素的條件下，置于33℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，使足細(xì)胞處于“允許生長(zhǎng)”的條件下生長(zhǎng)傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70％-80％融合時(shí)，不加□-干擾素，置于37℃、5％CO2孵育箱

5、內(nèi)＞12天，使足細(xì)胞處于“限制生長(zhǎng)”的條件下誘導(dǎo)分化，用于實(shí)驗(yàn)。本研究使用的是限制生長(zhǎng)的10-18代條件性永生小鼠足細(xì)胞。
　　在部分實(shí)驗(yàn)中足細(xì)胞用ERS誘導(dǎo)劑thapsigargin(0.25μM)處理24h。在阻斷實(shí)驗(yàn)中，在用200μg/mLAOPPs孵育足細(xì)胞24h之前分別用ERS抑制劑salubrinal(50μM)、ROS清除劑c-SOD(100U/mL)和NADPH氧化酶抑制劑DPI(10μ M)預(yù)處理1h。
　

6、　3.實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平
　　收集細(xì)胞，加入TRIzol試劑，按試劑盒說明進(jìn)行操作提取總RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒說明書操作將總RNA逆轉(zhuǎn)到cDNA上。實(shí)時(shí)定量PCR是按照PCR SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書完成。RT-PCR條件如下:95℃2分鐘，然后95℃30秒與60℃35秒重復(fù)循

7、環(huán)40次。
　　4.蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot analysis)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平
　　將細(xì)胞置于RIPA緩沖液中裂解，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再把PVDF膜浸泡在含5％脫脂奶粉的TBST中，室溫下封閉2h;用兔抗小鼠PERK、IRE1、ATF6、p-PERK、p-IRE1、cleaved ATF6、CHOP、Bcl-2、caspase-12、cleaved c

8、aspase-3和RAGE抗體（1∶1000稀釋）與PVDF膜在4℃孵育過夜。再用山羊抗兔二抗與上述PVDF膜在室溫下孵育1h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL)檢測(cè)蛋白，用Total Lab2.0定量條帶密度，以β-actin為內(nèi)參。
　　5.siRNA轉(zhuǎn)染
　　非特異性siRNA和RAGE、PERK、IRE1和ATF6的siRNA均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。按照試劑盒說明操作，用Lipofectamine2000將siRN

9、A轉(zhuǎn)染到足細(xì)胞。每段基因的靶向序列分別為:RAGE5'-GGUCAGAGCUGACAGUGAUTT-3',PERK5'-GCAGGTCCTTGGTAATCAT-3'，ATF65'-GCAAAGCAGCAGTCGATTA-3'，IRE15'-CCAATGTATGTCACAGAAA-3'.非特異性siRNA為陰性對(duì)照，Western blot檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后的干擾效果。
　　6.TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　按DeadEndT

10、MTUNEL系統(tǒng)說明檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞置于4％的多聚甲醛中在4℃溫度下固定30分鐘，再用0.1％ Triton X-100及0.1％檸檬酸鈉透化細(xì)胞，然后加入TdT酶及熒光素結(jié)合核苷酸在37℃孵育60分鐘。用熒光顯微鏡檢測(cè)標(biāo)記綠色熒光的凋亡細(xì)胞。用DAPI共染樣本確定細(xì)胞核以鑒別假陽性凋亡細(xì)胞。
　　結(jié)果：
　　1.AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生ERS
　　應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)了各組足細(xì)胞

11、GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)AOPPs呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性上調(diào)了足細(xì)胞GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)水平;而空白對(duì)照組和未修飾MSA組均無明顯上調(diào)，而且這兩組比較也無顯著差異，這說明GRP78、CHOP的過度表達(dá)與MSA的晚期氧化相關(guān)的。
　　2.AOPPs通過激活ERS誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡
　　我們應(yīng)用TUNEL的方法檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率。AOPPs刺激后足細(xì)胞的凋亡率較空白對(duì)照組和未修飾MSA

12、組顯著增加，而且ERS抑制劑salubrinal可部分阻斷AOPPs的效應(yīng)，而ERS激活劑thapsigargin則與AOPPs一樣顯著增加了足細(xì)胞凋亡率。
　　3.NADPH氧化酶介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)的ROS生成
　　AOPPs刺激后足細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于空白對(duì)照組及未修飾MSA組，而且NADPH氧化酶抑制劑(DPI)和ROS清除劑(c-SOD)顯著抑制了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。
　　4.NADPH

13、氧化酶依賴的ROS生成介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生ERS
　　應(yīng)用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶抑制劑(DPI)和ROS清除劑(c-SOD)顯著抑制了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞GRP78和CHOP的蛋白水平表達(dá)。
　　5.ERS參與了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞ROS生成
　　AOPPs刺激后足細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于空白對(duì)照組及未修飾MSA組，ERS抑制劑salubrinal部分阻斷了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞

14、內(nèi)ROS的生成;而ERS激活劑thapsigargin則與AOPPs一樣顯著增加了足細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。
　　6.NADPH氧化酶依賴的ROS生成介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡
　　應(yīng)用TUNEL方法檢測(cè)了DPI或c-SOD存在的情況下AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率，我們發(fā)現(xiàn)AOPPs刺激足細(xì)胞時(shí)加入DPI或c-SOD后細(xì)胞凋亡率均顯著低于單用AOPPs刺激足細(xì)胞組。
　　7.RAGE特異性siRNA的有效性檢測(cè)

15、>　　分別用針對(duì)RAGE的靶向siRNA或錯(cuò)義序列無功能的scramble siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，用Western blot方法檢測(cè)兩組足細(xì)胞的RAGE蛋白表達(dá)以評(píng)估siRNA轉(zhuǎn)染有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAGE的siRNA組較scramble siRNA組RAGE蛋白水平顯著降低，RAGE siRNA降低RAGE蛋白表達(dá)＞70％。
　　8.RAGE介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞ROS生成和ERS的發(fā)生
　　AOPPs刺激前分別用scr

16、amble siRNA（siNC組）或RAGE siRNA（siRNA組）轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，僅用scramblesiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后無AOPPs刺激作為陰性對(duì)照;檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平發(fā)現(xiàn)siRNA組顯著低于siNC組。應(yīng)用Western blot檢測(cè)結(jié)果表明RAGE siRNA轉(zhuǎn)染后顯著阻斷了AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞GRP78和CHOP的蛋白表達(dá)。
　　9.RAGE介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)足細(xì)胞ROS生成和ERS的發(fā)生
　　AOPP

17、s刺激前分別用scramble siRNA（siNC組）或RAGE siRNA（siRNA組）轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，再應(yīng)用TUNEL的方法檢測(cè)足細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)，RAGE siRNA轉(zhuǎn)染組足細(xì)胞的凋亡率顯著低于scramble siRNA轉(zhuǎn)染組。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果證實(shí)了AOPPs可誘導(dǎo)足細(xì)胞ERS發(fā)生，并且AOPPs通過激活ERS誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。其次，本研究也表明ERS參與AOPPs誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡是由AOPPs與足細(xì)胞

18、表面的RAGE結(jié)合后通過NADPH氧化酶依賴的ROS生成所介導(dǎo)的。再次，三條經(jīng)典的UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:PERK，ATF6和IRE1通路，均介導(dǎo)了ERS誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。最后，我們的研究證實(shí)兩ERS相關(guān)的凋亡途徑:CHOP-和caspase-12依賴途徑，均介導(dǎo)了ERS誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，而且Bcl-2的抑制參與了CHOP凋亡途徑。足細(xì)胞凋亡在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用，而且AOPPs的聚集在糖尿病腎病患者中普遍存在，因此，我們