Hela細胞與人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中miRNA Let-7及其靶基因的關(guān)系研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類在進化上高度保守的，內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它可以通過與靶基因mRNA的3'UTR互補配對結(jié)合的方式特異性的降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯從而調(diào)控基因的表達。MicroRNA let-7最早在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中發(fā)現(xiàn)，與線蟲的生長，時序性發(fā)育和從幼蟲到成蟲的形態(tài)轉(zhuǎn)換有關(guān)。目前，在人的基因組中，有13種前體序列，能夠生成10種成熟的let-7 miRNAs。我們先

2、前的研究表明let-7在流產(chǎn)蛻膜中的表達顯著低于在早孕蛻膜中的表達。假設let-7可以通過調(diào)控靶基因的表達參與早期妊娠維持。
　　目的；⑴預測let-7f-5p，let-7g-5p和let-7i-5p的靶基因；⑵在體外水平驗證let-7f-5p，let-7g-5p和let-7i-5p與各自候選靶基因的靶向關(guān)系。
　　方法；利用在線分析軟件(Target Scan，PicTar和MiRanda等)預測let-7f-5p，let

3、-7g-5p和let-7i-5p的靶基因。在三種不同的人的細胞系HEK293T, Hela和H-ESCs中過表達或敲減let-7f-5p，let-7g-5p，let-7i-5p后在mRNA和蛋白水平檢測各自候選靶基因的表達。
　　結(jié)果：①IGF2BP-1 mRNA3'UTR有l(wèi)et-7f-5p的結(jié)合位點;在HEK293T, Hela和H-ESCs這三種不同的細胞中轉(zhuǎn)染let-7f-5p模擬物后，qRT-PCR結(jié)果表明，IGF2BP

4、-1 mRNA的表達均顯著減少(P＜0.05);轉(zhuǎn)染let-7f-5p抑制劑后，IGF2BP-1的表達顯著上調(diào)(P＜0.05)。此外，在Hela細胞中過表達let-7f-5p后，同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)的結(jié)果顯示IGF2BP-1蛋白的表達顯著下調(diào)(P＜0.05);抑制let-7f-5p后，iTRAQ的結(jié)果顯示IGF2BP-1蛋白的表達顯著上調(diào)(P＜0.05)。②IGF-2R mRNA3'UTR有l(wèi)et-7g-5p的結(jié)合位點

5、;在Hela細胞中轉(zhuǎn)染let-7g-5p模擬物后，qRT-PCR和ELISA的結(jié)果顯示，IGF-2RmRNA和蛋白的表達顯著上調(diào)(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染let-7g-5p抑制劑后，qRT-PCR和ELISA的結(jié)果顯示，IGF-2R mRNA和蛋白的表達顯著下調(diào)(P＜0.05)。③LIF和IL-6 mRNA3'UTR都有l(wèi)et-7i-5p的結(jié)合位點;在HEK293T, Hela和H-ESCs細胞中轉(zhuǎn)染let-7i-5p模擬物后，qRT-PC

6、R的結(jié)果表明，三種細胞中LIF和IL-6 mRNA的表達均顯著升高(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染let-7i-5p抑制劑后，LIF和IL-6 mRNA的表達顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：IGF2BP-1可能是let-7f-5p的一個靶基因，let-7f-5p可以靶向負調(diào)控IGF2BP-1的表達。在mRNA水平，let-7i-5p與LIF和IL-6的表達呈正相關(guān)。在Hela細胞中，let-7g-5p的表達與IGF-2R的表達正相關(guān)，