水稻基腐病菌hfq和crp基因的功能研究.pdf

1、玉米狄克氏菌（Dickeyazeae，簡稱D.zeae，異名：Erwinia chrysanthemi pv.zeae）是一種世界性重要植物病原細菌，寄主范圍廣泛。由它引起的水稻細菌性基腐病是水稻上重要細菌病害之一，在我國及東南亞國家的局部稻區(qū)嚴重發(fā)生，導致水稻嚴重減產。目前對病原菌D.zeae的致病性及其致病性調控機理研究還不完善，hfq和crp分別編碼sRNA分子伴侶 Hfq和環(huán)腺苷單磷酸受體蛋白（CRP），它們在水稻基腐病菌中的作

2、用，尚不清楚。
　　為了明確hfq和crp在D.zeae中的致病作用，本論文以水稻基腐病菌DZJS-4為材料，通過無痕基因敲除的方法，構建獲得了DZJS-4的hfq和crp基因缺失突變體△hfq和△crp。表型測定結果表明，與野生型相比突變體△hfq和△crp的生長速率明顯下降、形成生物膜的能力減弱，纖維素酶和果膠酶的活性降低，在大白菜上的軟腐癥狀減弱，都失去了在寄主植物水稻上的致病力；其中，突變體△hfq的胞外蛋白酶和毒素的活性

3、均完全喪失，煙草上的HR能力減弱，顯著影響水稻種子萌發(fā)的抑制作用，且在不同環(huán)境壓力（低溫、高溫、10％乙醇、10%蔗糖、20%蔗糖）下的生存能力也明顯減弱；而突變體△crp產生胞外蛋白酶和毒素的能力下降，對水稻種子萌發(fā)和煙草HR影響較小。進一步功能互補分析結果表明，突變體△hfq和△crp的互補體表型特征均能恢復成野生型。
　　為了更進一步了解hfq對上下游基因的調控關系，本論文采用Illumina HiSeq200的測序平臺對水

4、稻基腐菌DZJS-4和突變體△hfq菌株進行了轉錄組學分析，并比較它們之間基因轉錄水平的差異，測序結果顯示，與野生型相比，△hfq中共有3537個基因轉錄豐度發(fā)生了改變，其中（|log2(FoldChange)|>1且qvalue<0.005）的差異基因有710個，347個基因上調表達，363個基因的轉錄受到抑制。同時，對其差異基因進行了GO富集分析和KEGG富集分析，結果發(fā)現，這些差異基因涉及細菌的鞭毛組成（Flagellar ass

5、embly），雙組分系統(tǒng)（Two-component system），脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism），細菌趨化性（Bacterial chemotaxis），ABC轉運蛋白（ABC transporters），細菌的分泌系統(tǒng)（Bacterial secretion system）等途徑。突變體△hfq中有22個T6SS基因及30個鞭毛系統(tǒng)基因的表達受到hfq的調控，趨化性基因簇中的32個基因也表出不同的轉錄水平

6、差異。此外，野生菌DZJS-4和突變體△hfq之間有43個sRNA的表達存在顯著差異。對候選sRNA靶標基因分析表明，每個候選sRNA都對應著多個靶標基因。選擇部分差異表達基因和候選sRNA進行實時熒光定量PCR，其結果與轉錄組測序基本吻合，Hfq正向調控hcp、vgrG、vasJ、vasD、impB、impC、zmsA、pelE、celZ、cytB、prtC及細菌代謝途徑中相關基因的表達，負調控鞭毛基因簇、yliB、ycgG、vfmE