基于數(shù)字PCR和等溫擴增的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法研究.pdf

1、截止至2014年，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積已達1.8億公頃，超過350種品系在全球28個國家種植，越來越多的國家批準轉(zhuǎn)基因作物的應用，并且這些數(shù)字仍在快速增長中。隨著全球貿(mào)易自由化的加強和轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物和產(chǎn)品的檢測要求也不斷提高。由于轉(zhuǎn)基因作物構建的復雜化、品系數(shù)量的增加和時有發(fā)生的作物或產(chǎn)品中低水平混雜轉(zhuǎn)基因成分等情況，迫切需要具有高靈敏度、精準、快速等特點的檢測方法以滿足轉(zhuǎn)基因檢測的需求。數(shù)字PCR及環(huán)介導等溫擴

2、增技術（LAMP）的出現(xiàn)及其應用，顯示其在轉(zhuǎn)基因檢測中可能具有良好的應用前景。本研究重點圍繞數(shù)字PCR和LAMP技術，開展轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品精準和快速檢測方法的研究工作。
　　第一部分是比較三大不同原理的主要數(shù)字 PCR平臺，并探究其在轉(zhuǎn)基因生物領域的適用性。本研究從動態(tài)范圍、絕對定量、相對定量、重復性等方面分析比較了三大數(shù)字PCR平臺的精確定量能力。并進一步將其應用于轉(zhuǎn)基因生物精確定量、拷貝數(shù)分析及標準物質(zhì)量值測定三個方面。
　　

3、數(shù)字PCR是一種基于泊松分布法的核酸分子絕對定量檢測方法。與實時熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR真正實現(xiàn)了對核酸分子的精確及絕對定量，因此已被廣泛應用于多種研究領域。我們的研究表明三種數(shù)字PCR平臺在轉(zhuǎn)基因絕對定量檢測中其結果精確度較高。由于分液數(shù)較多，ddPCR和3D-dPCR平臺比cdPCR擁有更為廣闊的絕對和相對定量范圍。另外，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品量值檢測、標準物質(zhì)定值和轉(zhuǎn)基因生物外源拷貝數(shù)分析中的應用研究均表明數(shù)字PCR是一種理想及適合的轉(zhuǎn)

4、基因檢測方法。
　　第二部分是一種核酸高通量可視化檢測平臺CALM（Capillary Array-basedLAMPforMultiplexvisual detection of nucleic acids）的建立及其在轉(zhuǎn)基因檢測中的應用。CALM是一種基于親疏水處理毛細管陣列和可視化環(huán)介導等溫擴增技術的核酸多指標便攜式快速分析平臺，具有高通量、尺寸微小、低成本及操作簡單等優(yōu)點。在CALM平臺中，毛細管陣列上下兩面被處理成超疏水

5、性，不同LAMP引物組被預先固定在相應毛細管內(nèi)壁上。這種設計使得LAMP反應體系可以利用虹吸作用一次性加入到毛細管陣列中所有的毛細管內(nèi)而在毛細管間相互分隔。經(jīng)過并行進行的LAMP反應后，反應結果可以直接通過肉眼讀出。在此平臺基礎上,我們成功實現(xiàn)了對于八種非常重要和常用的轉(zhuǎn)基因作物相關基因的并行檢測。檢測結果表明本平臺具有較高的特異性和靈敏度。此外，從海關收集到的轉(zhuǎn)基因作物真實樣本的檢測結果與獨立進行的real-time PCR結果完全一