鼠疫耶爾森氏菌小RNA RyhB1和RyhB2調控和生理比較研究.pdf

1、研究背景:
　　 鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（簡稱鼠疫菌）引起的一種自然疫源性疾病。在自然界鼠疫菌主要在嚙齒動物間傳播，也可通過蚤叮咬或者其它途傳染給人，引發(fā)腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫。在機體感染早期，鼠疫菌能在巨噬細胞內存活并繁殖，是鼠疫菌得以最終致病的關鍵階段。鼠疫菌在媒介（跳蚤）和宿主（哺乳動物）間循環(huán)的過程中，不可避免地遭遇多個信號（溫度、離子濃度、滲透壓、pH、氧、自由基、過氧化物、碳源、氮源等）的協(xié)同刺激，一旦進入宿主體

2、內，病原菌能夠有效感應這些信號并迅速做出反應，通過調動多種調控機制適應環(huán)境壓力。
　　 細菌中除了蛋白質類的調控因子之外，還存在著一些發(fā)揮調控作用的非編碼RNA（small non-coding regulatory RNA，sNRA），也稱為小RNA。小RNA廣泛存在原核生物，通常位于基因間區(qū)(IGR)，長度為50-500bp左右，轉錄后一般不翻譯為蛋白質，有特殊的莖環(huán)結構，可通過堿基反向互補調控靶mRNA翻譯和穩(wěn)定性。小RN

3、A作為一種有效的調節(jié)分子，在對原核生物生理和毒力功能的調節(jié)中起到十分重要作用。如可直接感應溫度、pH值、氧氣濃度和營養(yǎng)條件等環(huán)境信號，參與細菌鐵代謝、壓力反應、碳代謝、糖利用、外膜平衡、密度感應、毒力等生理功能的調控。細菌小RNA對靶mRNA調控大多需要Hfq(host factorfor RNA phage Qβ replicase）伴侶蛋白的參與。Hfq是一種RNA結合蛋白，存在于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中，胞內形成六聚體結構，是一

4、種高度保守的耐熱蛋白。在調節(jié)過程中，Hfq與小RNA分子結合，促進RNA分子間配對和穩(wěn)定小RNA，被認為是細菌基因轉錄后的關鍵調控因子。
　　 對大多數(shù)生物來說，鐵是一把雙刃劍。正因為如此，細菌進化過程中已經(jīng)形成一套鐵穩(wěn)態(tài)調節(jié)系統(tǒng)來維持合適的細胞內鐵水平，既要滿足正常的生理需要，又能防止其毒性作用。細菌中，F(xiàn)ur(ferric uptake regulator)蛋白是一種關鍵的轉錄抑制蛋白，控制鐵代謝和Fe2+作為輔助因子的利用

5、。低鐵時，F(xiàn)ur蛋白失活，鐵攝取相關基因表達。相反，鐵離子濃度增加時，F(xiàn)ur蛋白激活，鐵攝入基因表達抑制，含鐵蛋白和鐵儲存蛋白基因表達激活。在腸桿菌科中，這種激活多需要兩步連續(xù)的抑制，即Fur蛋白抑制一個90nt的調節(jié)小RNA—RyhB的轉錄，繼而在Hfq的輔助下，RyhB與含鐵蛋白編碼基因mRNA互補配對，抑制后者的翻譯和促進mRNA的降解。其中，Hfq蛋白作為伴侶蛋白，可增強RyhB穩(wěn)定性，在轉錄后水平調控靶mRNA。因此，RyhB

6、能通過抑制鐵利用相關蛋白的表達，增加細胞內鐵離子濃度，確保鐵必需蛋白的鐵利用，維持細胞鐵穩(wěn)態(tài)。
　　 與蛋白類調節(jié)子類似，同一個小RNA可調控多個靶分子。RyhB是目前已知調控靶mRNA數(shù)目最多的小RNA。目前已經(jīng)鑒定大腸埃希氏菌RyhB直接調控的轉錄本共22個，共涉及64個基因，涉及三羧酸循環(huán)(TCA)、糖酵解、氧化應激、鐵-硫簇形成以及需氧和厭氧呼吸等，除此以外，RyhB還能負反饋調fur基因的表達。RyhB除了與鐵代謝功能

7、相關外，在霍亂弧菌和痢疾志賀氏菌中，還發(fā)現(xiàn)RyhB的轉錄還影響到細菌動力、化學趨化、生物膜、酸耐受、氧化還原甚至毒力基因的表達等。
　　 鐵代謝在鼠疫菌致病過程中至關重要，而RyhB又是其中關鍵的調節(jié)小RNA。我們對腸桿菌科基因組序列進行了分析，結果發(fā)現(xiàn):大多數(shù)基因組內只存在一個RyhB，而只有耶爾森氏菌和沙門氏菌基因組內存在兩個RyhB同源拷貝，其中一個拷貝可能是進化分支過程中獲得的。鼠疫耶爾森氏菌兩個RyhB——RyhB1和

8、RyhB2都位于染色體上，且相距較遠。同源性比對分析發(fā)現(xiàn):鼠疫菌RyhB二者序列同源性達到69％，與大腸埃希氏菌和沙門氏菌RyhB相比，同源性在61％到72％之間。
　　 在細菌RyhB調控方面的認識已經(jīng)較為深入。然而，多數(shù)細菌基因組內僅存在一個RyhB，在沙門氏菌和耶爾森氏菌進化獲得的另一個拷貝，究竟在細菌生理乃至致病過程中發(fā)揮怎樣的作用？二者調控與生理功能的比較研究將有助于解決以下問題:二者是否功能冗余，可否相互疊加？它們各

9、自調控的靶分子有哪些？存在哪些共同或差異的轉錄調節(jié)特征？因此，本課題旨在比較分析鼠疫菌兩個RyhB的轉錄調節(jié)特征，尋找RyhB進化過程中可能獲得的新的調節(jié)規(guī)律，并將靶分子調節(jié)特征與生理乃至致病表型聯(lián)系起來。
　　 方法:
　　 基于λ-Red同源重組原理，本研究利用兩步PCR法構建RyhB1和RyhB2單、雙基因缺失突變株，在雙缺失突變株基礎上，構建RyhB1和RyhB2的誘導表達株。
　　 提取對數(shù)中期低鐵條件

10、下的鼠疫菌野生株菌體總RNA，設計分別針對RyhB1和RyhB2特異引物，采用引物延伸實驗尋找RyhB1和RyhB2各自轉錄起始位點，并結合生物信息學預測分析鼠疫菌RyhB1和RyhB2序列特征。提取鼠疫菌野生株、
　　 △ryhB1、△ryhB2、△ryhB1(∶)△ryhB2、△fur和△hfq突變株不同條件下（高鐵、低鐵不同時間點）的菌體總RNA，利用Northern Blotting技術驗證上述條件下RyhB1和RyhB

11、2的轉錄情況。另外，低鐵條件下加入利福平0、2、4、8、16、32min后，測定野生株和△hfq突變株RyhB1和RyhB2轉錄水平，計算各自半衰期。
　　 鼠疫菌RyhB1和RyhB2誘導表達株在阿拉伯糖誘導后，提取對照組（空載體）和RyhB1和RyhB2誘導表達株總RNA和總蛋白，用于芯片轉錄組（轉錄水平）和2D差異蛋白譜（翻譯水平）分析，尋找差異表達的基因，獲得轉錄水平的RyhB1和RyhB2調控元，并對基因功能進行分類。

12、
　　 在繪制生長曲線和觀察菌落形態(tài)基礎上，結合RyhB調控元分析結果和鼠疫菌傳播致病特點，確定表型研究的主要內容。利用體外生長和存活實驗，比較鼠疫菌野生株和△ryhB突變株對短期刺激（如氧化脅迫）和長期刺激（如高鹽、低鐵和營養(yǎng)缺乏）的敏感性或耐受性。鼠疫菌野生株和△tyhB突變株以皮下感染BALB/C小鼠，最終計算半數(shù)致死劑量(LD50);鼠疫菌野生株和突變株等量混合后，大劑量滴鼻感染小鼠，分析動物體內臟器的細菌分布情況，并計

13、算競爭指數(shù)(competitive index，CI)。
　　 統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件。計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組的均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)的比較先進行方差齊性檢驗，若方差齊，則采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法;若方差不齊采用近似F檢驗的Welch方法，多重比較采用Dunnett's T3檢驗。三種不同株（WT、△hfq、△fur）在高低鐵環(huán)境下對RyhB1和RyhB2的

14、表達量的影響采用三因素的析因設計方法。DIP誘導不同時間對RyhB表達的影響，使用單組重復測量方差分析，若不滿足球形檢驗則使用Greenhouse-Geisserε校正系數(shù)的結果，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 成功構建△ryhB1、△ryhB2.△ryhB1:△ryhB2、△ ryhB1:△ryhB2(∶)△fur三敲除株及pBAD-RyhB1，pBAD-RyhB2過表達株。通過生物信息學分析

15、，鼠疫菌有兩個拷貝RyhB1和RyhB2，同源性高（一致序列為69％），啟動子區(qū)存在Fur結合位點、-10區(qū)，-35區(qū)、核心保守序列(31nt)和非依賴p的轉錄終止子序列。引物延伸試驗能確定RyhB1和RyhB2轉錄起始位點與生物學預測結果一致。
　　 Northern Blotting檢測不同菌株低鐵和高鐵條件下RyhB1和RyhB2的轉錄水平結果顯示:RyhB1和RyhB2均在低鐵條件下高表達，當fur基因缺失后，RyhB水

16、平上調，提示鼠疫菌RyhB1和RyhB2均受鐵和Fur蛋白負調節(jié)，這一點與大腸埃希氏菌RyhB調節(jié)是一致的。
　　 在檢測低鐵不同時間野生株和hfq缺失突變株RyhB轉錄水平時，我們發(fā)現(xiàn):在野生株中，RyhB1和RyhB2在低鐵30 min時仍然很穩(wěn)定;而當hfq缺失時，RyhB2仍能保持穩(wěn)定，而RyhB1不穩(wěn)定。半衰期結果顯示:在hfq缺失時，RyhB2的半衰期遠高于RyhB1。這一結果提示:RyhB1的穩(wěn)定性依賴于Hfq，而

17、RyhB2不依賴。
　　 在調控元分析方面，提取誘導條件下鼠疫菌RyhB1和RyhB2表達株的總RNA，用于芯片轉錄組分析，初步結果提示:RyhB1和RyhB2存在共同的和差異的調控元。兩者共同調控的轉錄本有47個，RyhB1獨自調控的轉錄本有31個，RyhB2獨自調控的轉錄本有58個，對上述136個基因進行了功能分類，轉錄調控的基因按功能分為12類。
　　 通過蛋白質組學技術獲得18個差異蛋白兩個RyhB既有獨自的靶標

18、，又有共同的靶標，生物芯片和質譜分析RyhB2均調控相同靶基因如hmsF，兩者結果一致。
　　 檢測肺鼠疫模型中小鼠肺、脾臟器中鼠疫菌RyhB1和RyhB2的轉錄水平，結果發(fā)現(xiàn):鼠疫菌RyhB1和RyhB2在小鼠肺內高表達，提示RyhB在鼠疫菌生理、體內適應和致病過程中可能發(fā)揮重要作用。然而，通過表型試驗和動物試驗來研究RyhB1和RyhB2對生理和毒力的影響。野生株和RyhB1和RyhB2缺失突變株在營養(yǎng)豐富或缺乏、低鐵和高鹽

19、等條件下不會影響細菌的生長未見明顯的生長差異。當用220 mmol/L H2O2刺激野生株和ryhB單雙敲除株，發(fā)現(xiàn)△ryhB1(∶)△ryhB2生存率較野生株降低。將野生株與ryhB雙敲除株等量混合感染小鼠后，都能從肺和脾中分離到兩種菌株。在肺中的CI值分別為:48h為3.75，72h為1.14:在脾中的CI值:48h為0.7，72h為1.7。上述結果說明當RyhB缺失后，并不影響鼠疫菌在體內生長和繁殖過程，鼠疫菌在小鼠體內生存能力無

20、明顯變化。在小鼠生存試驗中，鼠疫菌ryhB突變株跟野生株相似，均在4-8d內都死亡，說明RyhB可能不直接參與小鼠致病。
　　 結論:
　　 1.在本實驗室搭建了成熟的兩步法小RNA缺失、非放射性標記Northernblot檢測及誘導表達的三個技術平臺，為小RNA基因功能研究奠定了基礎。
　　 2.鼠疫菌RyhB1和RyhB2受鐵離子和Fur蛋白負調控。
　　 3.RyhB1穩(wěn)定性依賴Hfq，而RyhB2

21、不依賴。這是同類小RNA存在穩(wěn)定性差異的最新證據(jù)，為探討sRNA降解機制提供了新的思路。
　　 4.鼠疫菌RyhB1和RyhB2調控元分析顯示二者有相同也有差異靶標，提示二者除了共同在鐵代謝過程中發(fā)揮作用外，還可能在其它代謝途徑中發(fā)揮各自不同的作用。
　　 5.本研究結果顯示缺失ryhB后，鼠疫菌耐受H2O2能力明顯下降，提示RyhB可能在抗氧化過程中發(fā)揮作用。而RyhB2過表達時，HmsF的上調也提示RyhB2很可能與