大豆疫霉分子檢測(cè)及SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā).pdf

1、大豆疫霉引起的大豆疫霉根腐病是大豆上的重要病害，每年在大豆主產(chǎn)國(guó)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，該菌也是我國(guó)重要的進(jìn)境檢疫有害生物之一。因此，研究大豆疫霉的快速、準(zhǔn)確鑒定技術(shù)以及開(kāi)發(fā)有效的分子標(biāo)記系統(tǒng)用于種群變異和進(jìn)化分析等研究具有重要意義。 本研究旨在開(kāi)發(fā)大豆疫霉特異的分子標(biāo)記，建立用于大豆病株及土壤檢測(cè)的PCR技術(shù)體系，為防止該菌的傳播和及時(shí)制定病害防治策略奠定基礎(chǔ);通過(guò)對(duì)大豆疫霉全基因組序列的查詢開(kāi)發(fā)有效SSR標(biāo)記，檢測(cè)SSR標(biāo)記用于

2、大豆疫霉遺傳多樣性分析的有效性和在其他近緣物種的通用性，以期為大豆疫霉的遺傳變異、分子作圖和系統(tǒng)進(jìn)化等研究提供一種更加有效的分子標(biāo)記系統(tǒng)。主要研究結(jié)果如下： 1.從大豆疫霉細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅱ(coxⅡ)序列和兩個(gè)激發(fā)素(elicitin)家族基因EST序列中開(kāi)發(fā)了3對(duì)大豆疫霉特異引物：Cox3-F/Cox3-R、PSEL1-F/PSEL1-R和PSEL2-F/PSEL2-R。這3對(duì)引物在大豆疫霉中分別擴(kuò)增出450bp、289b

3、p和370bp的特異性片段，檢測(cè)大豆疫霉基因組DNA的靈敏度分別為20pg/μL、2pg/μL和2pg/μL。3對(duì)引物能夠有效檢測(cè)大豆疫霉侵染的大豆病株，可以用于病害診斷和鑒別。 2.基于保守的EST-SSR標(biāo)記Psc239，在原引物對(duì)的外側(cè)重新設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物Psc239EF/Psc239ER，構(gòu)建檢測(cè)大豆疫霉的巢式PCR技術(shù)體系。經(jīng)過(guò)對(duì)36株P(guān).sojae、25株對(duì)照菌和2個(gè)大豆品種檢測(cè)，這兩對(duì)引物單獨(dú)擴(kuò)增及巢式PCR均表現(xiàn)

4、對(duì)大豆疫霉的特異性，Psc239EF/Psc239ER、Psc239和巢式PCR分別只在大豆疫霉擴(kuò)增出519bp、242bp和242bp的特異片段。單對(duì)引物檢測(cè)基因組DNA的靈敏度均為50pg/μL，而巢式PCR為50fg/μL。該巢式PCR方法可以特異地從大豆病株及土壤中檢測(cè)到大豆疫霉，檢測(cè)土壤中卵孢子的靈敏度為每1g土壤0.4個(gè)卵孢子。對(duì)22份隨機(jī)大豆田土樣中進(jìn)行檢測(cè)，16份土樣為陽(yáng)性，而使用葉碟誘釣方法只檢測(cè)出12份陽(yáng)性土樣。

5、 3.通過(guò)對(duì)大豆疫霉基因組序列查詢選出重復(fù)次數(shù)較多的260個(gè)SSRs設(shè)計(jì)引物，經(jīng)10個(gè)大豆疫霉基因組DNA篩選，設(shè)計(jì)的260對(duì)SSR引物有213對(duì)能擴(kuò)增出SSR特征條帶，占引物總數(shù)的81.9％。其中多態(tài)引物有114對(duì)，占53.5％，條帶差異多態(tài)性引物72對(duì)，占33.8％。通用性檢測(cè)結(jié)果顯示部分引物在11株其他疫霉菌中表現(xiàn)一定的通用性?；?0個(gè)SSR標(biāo)記的聚類分析表明，這些標(biāo)記可以將大豆疫霉及其他疫霉區(qū)分開(kāi)。 4.用18對(duì)S

6、SR引物分析大豆疫霉菌株的遺傳多樣性。18對(duì)SSR引物在108個(gè)大豆疫霉菌株中共擴(kuò)增出119個(gè)等位變異，變異范圍為4-9，平均為6.61個(gè)，表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，從而可以用于大豆疫霉遺傳多樣性的分析。對(duì)來(lái)自6個(gè)不同地區(qū)的大豆疫霉的遺傳多樣性分析表明，中國(guó)大豆疫霉存在豐富的遺傳多樣性；黑龍江、安徽和美國(guó)菌株的遺傳多樣性比較高，這些地方的菌株可能存在廣泛的遺傳變異；新疆菌株與黑龍江菌株的遺傳距離最近，初步認(rèn)為新疆的大豆疫霉可能來(lái)自黑龍江；安徽