紅曲霉酸性蛋白酶基因的同源表達及液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化研究.pdf

1、紅曲霉(Monascus)作為重要的絲狀真菌被廣泛地運用于生產當中。國內外對紅曲霉產色素、莫納可林K、γ-氨基丁酸研究較多；在遺傳轉化方面，對黑曲霉、米曲霉等其他絲狀真菌研究較深入，但對紅曲霉的遺傳轉化，特別是同源轉化研究較少。酸性蛋白酶也稱為天冬氨酸蛋白酶，是紅曲霉一種重要的代謝產物,也是一種常用的蛋白水解酶。在釀酒中提高酸性蛋白酶含量，可強化蛋白質的水解，有利于酯的合成，從而改善酒品質。但目前酸性蛋白酶酶制劑成本高、活性低，不能廣泛

2、運用于生產。
　　本文以紅曲霉的酸性蛋白酶為研究對象，通過擴增獲取紅曲霉的酸性蛋白酶基因，測序后對其進行生物信息學分析。研究結果表明紅曲霉酸性蛋白酶基因全長1188bp，其蛋白酶分子量預測為41.4 Ku。該蛋白為親水性蛋白，無配體，有一個卷曲螺旋區(qū)域，有信號肽，它最可能的剪切位點在第20和21位點間，為分泌型蛋白。無跨膜螺旋區(qū)，不能引發(fā)紅曲霉的信號轉導。紅曲霉酸性蛋白酶有9個絲氨酸激酶潛在磷酸化位點、1個蘇氨酸激酶潛在磷酸化位點

3、、4個酪氨酸激酶潛在磷酸化位點。其序列與酸性蛋白酶的家族模式吻合，有兩個功能位點，且與赤曲霉的酸性氨蛋白酶以相同速率進化。環(huán)境對該基因轉錄水平的影響為：當環(huán)境水分含量為80％時，紅曲霉酸性蛋白酶基因轉錄水平達到最大；培養(yǎng)溫度為23℃時，紅曲霉酸性蛋白酶基因轉錄水平達到最大；pH為6-7時，紅曲霉酸性蛋白酶基因轉錄水平較高。對紅曲霉酸性蛋白酶基因的重組載體進行了構建，利用根癌農桿菌介導技術將重組載體導入紅曲霉。結果表明：載體 pBC-Hy

4、gro能夠實現(xiàn)紅曲霉目的基因的同源轉化，且用該載體構建的重組子遺傳穩(wěn)定性較好。在其啟動子 Neurospora crassa cpc-1的作用下，能夠實現(xiàn)強啟動，獲得目的基因的高表達。紅曲霉轉化子中酸性蛋白酶基因的轉錄水平是野生型菌株的3.3倍。同時，用根癌農桿菌介導法進行紅曲霉遺傳轉化，成功實現(xiàn)了受體細胞紅曲霉孢子的轉化。此外，對紅曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行了單因素變量優(yōu)化，其結果表明：每100mL水加入麥芽糖13g、酵母提取物10.