納米銅對豬腎細胞線粒體凋亡途徑的影響.pdf

1、納米銅作為納米科技迅猛發(fā)展的重要成果，越來越廣泛的應用于養(yǎng)殖業(yè)、飼料行業(yè)等畜牧獸醫(yī)相關(guān)領(lǐng)域。在畜牧業(yè)中，銅作為一種促生長劑被廣泛的使用，但傳統(tǒng)的銅添加劑吸收利用率低，大量銅隨糞便排出，污染了土壤環(huán)境的同時也造成了極大的浪費。而使用納米銅作為飼料添加劑可顯著提高表觀消化率、提高生產(chǎn)性能和機體免疫力。但伴隨著納米銅高利用率和效能而來的生物安全性問題也逐漸凸顯出來。研究表明，納米銅的主要靶器官是腎臟和肝臟，反復經(jīng)口染毒可引起腎臟和肝臟的損傷;

2、離體實驗顯示，培養(yǎng)基中添加過量的納米銅可以誘導細胞形態(tài)學的變化和細胞器的損傷，同時納米銅還可以劑量依賴性的誘導細胞的凋亡，并在此過程中伴隨著線粒體膜電位的改變，線粒體膜電位的改變被看成是細胞凋亡線粒體途徑（內(nèi)源性途徑）的起始事件，但關(guān)于納米銅與線粒體途徑凋亡關(guān)系的更進一步研究尚未發(fā)現(xiàn)報道。
　　本實驗就以豬的腎上皮細胞作為實驗材料，進行20、40、60、80μg/mL四種不同劑量納米銅的染毒處理，通過對豬腎上皮細胞的形態(tài)學變化、凋

3、亡率、線粒體膜電位的變化以及細胞內(nèi)Bid、Bax、Caspase-3和細胞色素C的mRNA表達變化情況的觀察，探討了納米銅和細胞凋亡的劑量效應關(guān)系，以闡述納米銅對細胞凋亡中線粒體途徑的影響。實驗結(jié)果顯示:
　　1.應用HE染色、AO/EB雙熒光染色，觀察納米銅對腎上皮細胞的誘導凋亡作用，可以觀察到細胞收縮變圓，細胞間距增大。從形態(tài)學角度證實納米銅能夠引發(fā)腎上皮細胞的凋亡，且腎上皮細胞的凋亡指數(shù)與培養(yǎng)基中添加的納米銅劑量呈正相關(guān)。<

4、br>　　2.應用FITC-PI染色法，使用流式細胞術(shù)觀察納米銅對腎上皮細胞凋亡率的影響，結(jié)果顯示四組細胞的總凋亡率分別為16.77％、17.04％、25.93％、30.25％。表明培養(yǎng)基中添加不同濃度的培養(yǎng)基均能使細胞的凋亡率上升，且腎上皮細胞的凋亡率與培養(yǎng)基中添加的納米銅呈正相關(guān)，證實了在培養(yǎng)基中添加納米銅能誘導細胞的凋亡。
　　3.使用JC染色法，用流式細胞儀檢測腎上皮細胞線粒體膜電位的變化情況，結(jié)果顯示培養(yǎng)基中添加四種不同

5、濃度的納米銅引起細胞線粒體膜電位變化的百分率分別為8.72％、10.14％、28.43％、57.44％，證實了納米銅確實可以引起線粒體膜電位的變化從而影響細胞的線粒體凋亡途徑。
　　4.應用熒光定量PCR技術(shù)，檢測在添加納米銅后3、6、12、24h四個時間段和20、40、60、80μg/mL四種不同濃度的納米銅對細胞線粒體凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白Bid、Bax、caspase-3以及細胞色素C的mRNA表達量變化。實驗結(jié)果顯示，Bid和

6、Bax基因在40到60μg/mL濃度區(qū)間時表達量達到峰值，并且有隨著時間延長峰值有前移的趨勢，揭示了在此濃度區(qū)間內(nèi)，Bid與Bax大量生成并共同作用在線粒體膜上，增大了線粒體膜對于細胞色素C的通透性。細胞色素CmRNA的表達量在3、6h組中的表達量隨濃度的增加而增加，在60μg/mL濃度時達到最大而在最高濃度80μg/mL時略微下降;在12、24h組中，峰值前移在40μg/mL濃度時就達到最大。Caspase-3的mRNA受時間影響不大