家蠶脂肪酶1基因啟動子特性及其在品系間的表達(dá)差異.pdf

1、家蠶脂肪酶Bmlipase-1是一種消化酶,其主要生理功能是消化水解脂類與脂蛋白;然而Bmlipase-1可以在BmNPV感染的起始階段,抑制病毒的擴(kuò)增,保護(hù)中腸上皮組織細(xì)胞免受BmNPV-ODV的感染。Bmlipase-1具有中腸組織表達(dá)特異性,在蠶體第一道免疫防線中發(fā)揮抵抗病毒的作用。本文對Bmlipase-1啟動子調(diào)控區(qū)進(jìn)行了分析研究,為篩選獲得可用于轉(zhuǎn)基因家蠶研究的特異性啟動子提供了基礎(chǔ)信息,同時也有利于進(jìn)一步闡明Bmlipas

2、e-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理;此外,檢測了Bmlipase-1在不同家蠶品系幼蟲中腸組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,探究了Bmlipase-1的表達(dá)與家蠶對BmNPV的抗性之間的關(guān)系。本研究主要包括以下兩部分內(nèi)容:
　　1、從家蠶基因組DNA中克隆了Bmlipase-1啟動子調(diào)控序列,測序鑒定后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果,PCR克隆獲得系列缺失不同元件的啟動子片段,以EGFP作為報(bào)告基因,利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有上述

3、啟動子片段的報(bào)告質(zhì)粒;用重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并體腔注射家蠶,通過熒光觀察、熒光定量PCR和ELISA檢測,在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對報(bào)告基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。
　　所克隆序列涵蓋Bmlipase-1的第1外顯子(1～52)、第1內(nèi)含子(53～935)、核心啟動子區(qū)(-100～-1)和5’上游區(qū)(-1980～-101)四部分,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)緊鄰區(qū)域內(nèi)未預(yù)測到可識別的TATA盒。根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)量高低,不同長度啟動子片段的活性趨勢為:

4、-1453～192區(qū)最高,-1453～955區(qū)和-678～192區(qū)第二,-678～955區(qū)第三,-383～955區(qū)和-81～955區(qū)第四,-1980～955區(qū)和494～955區(qū)最低。由此推測:-1453～-679區(qū),-678～-384區(qū)和-81～493區(qū)可能存在正調(diào)控啟動元件,其中-1453～-679區(qū)的正調(diào)控作用最強(qiáng),-678～-384區(qū)居中,-81～493區(qū)較弱;-1980～-1454區(qū)和193～955區(qū)可能存在負(fù)調(diào)控元件;-383

5、～-82區(qū)的調(diào)控作用不顯著。其中,-1453～-679區(qū)含有家蠶中腸組織特異性相關(guān)基因啟動子保守序列,同時包含1個CAAT盒和大量GATA序列,推測該區(qū)域可能與Bmlipase-1的組織表達(dá)特異性相關(guān);-81～493區(qū)含有核心啟動子區(qū)、第1外顯子和部分第1內(nèi)含子序列,同時包含大量Pbx-1結(jié)合位點(diǎn)、OTC序列和GATA序列,推測該區(qū)域?qū)τ贐mlipase-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有基礎(chǔ)作用。
　　2、以具有不同BmNPV抗性水平的6個家蠶品

6、系為材料,利用實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)技術(shù),檢測Bmlipase-1在不同品系健康幼蟲中腸組織的表達(dá)水平及感染BmNPV后幼蟲中腸組織中該基因的表達(dá)水平,探究該基因表達(dá)與家蠶對BmNPV的抗性之間的關(guān)系。
　　一方面,不同家蠶品系間Bmlipase-1的表達(dá)水平差異顯著,抗性較強(qiáng)的品系,其表達(dá)水平較高,供試品系中NIL·LVR的Bmlipase-1表達(dá)水平最高,p50、CVDAR18、nsd·NIL依次降低,892和306

7、最低。NIL·LVR品系5齡期Bmlipase-1的平均表達(dá)量約為306品系的8.2倍。另一方面,BmNPV能夠誘導(dǎo)Bmlipase-1的表達(dá),但不同品系間該基因的誘導(dǎo)表達(dá)差異顯著,抗性較強(qiáng)的品系,其誘導(dǎo)表達(dá)水平相對較高,供試品系中NIL·LVR的Bmlipase-1誘導(dǎo)表達(dá)水平最高,p50其次,CVDAR18和nsd·NIL第三,892和306最低。NIL·LVR品系經(jīng)BmNPV感染誘導(dǎo)后Bmlipase-1的5齡期平均表達(dá)量約為30