模擬微重力誘導(dǎo)成骨細(xì)胞微絲變化對(duì)成骨細(xì)胞標(biāo)志產(chǎn)物(骨鈣蛋白、堿性磷酸酶)及NO-NOS系統(tǒng)的影響.pdf

1、背景：隨著載人航空事業(yè)的發(fā)展,太空失重導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松越來(lái)越受到科學(xué)家的關(guān)注,空間飛行試驗(yàn)積累的資料已經(jīng)總結(jié)出,失重性骨質(zhì)稀少的主要原因是骨形成的減少而不是骨吸收的增強(qiáng)。成骨細(xì)胞是骨形成、發(fā)育和生長(zhǎng)過(guò)程中的重要細(xì)胞。以往的研究熱點(diǎn)主要集中在微重力對(duì)成骨細(xì)胞分化過(guò)程的影響,隨著細(xì)胞學(xué)研究的發(fā)展,對(duì)于失重性骨質(zhì)疏松的研究漸漸聚集在細(xì)胞分子水平的探索。對(duì)微重力條件下,成骨細(xì)胞感受和傳導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達(dá)等發(fā)生的變化都取得了一

2、定的進(jìn)展。
　　 大量研究發(fā)現(xiàn),微重力導(dǎo)致細(xì)胞分化成熟相關(guān)物質(zhì)(堿性磷酸酶,骨鈣素和Ⅰ型膠原)的mRNA表達(dá)及蛋白合成減少,還導(dǎo)致成骨細(xì)胞COX-2的基因表達(dá)下調(diào)及PGE2和NO分泌量增加。也有研究表明細(xì)胞骨架系統(tǒng)對(duì)微重力環(huán)境非常敏感,細(xì)胞骨架微管和微絲重排可能參與微重力導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)及功能變化過(guò)程。
　　 近年來(lái),NO在骨質(zhì)疏松發(fā)展過(guò)程中作為信息分子的生理作用也已被人們重視。已經(jīng)達(dá)成共識(shí)的是,成骨細(xì)胞的增殖及其骨基質(zhì)蛋

3、白分泌的功能依賴于少量NO的存在,而高濃度的NO既抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化,還顯著抑制成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性和抑制成骨細(xì)胞合成骨鈣素等骨基質(zhì)蛋白。而NO是由NOS(nitric oxide synthase,NOS)以L-精氨酸為底物合成的,NOS作為一種局部信號(hào)分子,不同亞型的NOS所生成的不同濃度的NO對(duì)成骨細(xì)胞具有完全不同的生理意義。已有研究表明,微重力可促使NO/NOS系統(tǒng)發(fā)生一系列改變,如NO濃度增多等。
　　 本實(shí)

4、驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)模擬微重力誘導(dǎo)微絲改變后,檢測(cè)出成骨細(xì)胞NO/NOS系統(tǒng)的改變及成骨細(xì)胞標(biāo)志產(chǎn)物(堿性磷酸酶和骨鈣素)的變化,由此探討失重導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的機(jī)制,是否是微重力誘導(dǎo)微絲改變影響NO/NOS信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)而導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生改變而影響細(xì)胞的分化過(guò)程。
　　 目的：本研究主要從細(xì)胞水平探討失重導(dǎo)致骨丟失的機(jī)制。通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞骨架微絲的觀察及NO/NOS系統(tǒng)和成骨細(xì)胞標(biāo)志產(chǎn)物的檢測(cè),得出它們之間的關(guān)聯(lián)性,以期為失重性骨質(zhì)

5、疏松的機(jī)制研究提供新的線索。
　　 對(duì)象和方法：
　　 1.細(xì)胞株及其培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)所用的小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3一E1是由南方醫(yī)科大學(xué)解剖教研室提供。實(shí)驗(yàn)時(shí)均采用同一批凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的第三代細(xì)胞,以保證細(xì)胞性狀的穩(wěn)定性。細(xì)胞用含10％胎牛血清(FBS)和雙抗的低糖DMEM培養(yǎng),2天換液,4天傳代。
　　 2.成骨細(xì)胞株活性鑒定:采用茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色法檢測(cè)體外礦化能力。
　　 3.建立模擬微重力成骨細(xì)胞模型

6、、分組干預(yù):實(shí)驗(yàn)分為正常重力組、模擬微重力組、模擬微重力+0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組、0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組。
　　 4.細(xì)胞染色:用FITC標(biāo)記的phalloidin對(duì)細(xì)胞骨架微絲進(jìn)行染色,用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。
　　 5.ALP活性測(cè)定:對(duì)硝基苯酚法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALP活性。
　　 6.OCN表達(dá)量測(cè)定:運(yùn)用ELISA測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中OCN的表達(dá)量。
　　 7.NO含

7、量測(cè)定:用硝酸還原酶法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度。
　　 8.NOS活性測(cè)定:使用NOS分型試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液中NOS的酶活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.成骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況:MC3T3-E1細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后,在相差顯微鏡下呈三角形、菱形、多邊形等不規(guī)則形狀,透明度好。細(xì)胞有觸突,胞漿豐富并向外伸展,伸出幾個(gè)突起與臨近細(xì)胞伸出的突起相連,有聚集成團(tuán)(集落)的現(xiàn)象。胞核大而清楚,呈圓形或卵圓形,含1～2個(gè)核仁。

8、
　　 2.體外礦化能力檢測(cè):末次傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)至2周后細(xì)胞呈復(fù)層狀生長(zhǎng),中心部細(xì)胞密集可發(fā)生鈣化,形成肉眼可見(jiàn)的散在白色點(diǎn)狀物。茜素紅法礦化結(jié)節(jié)染色后,鈣鹽沉積區(qū)域呈紅色。
　　 3.細(xì)胞微絲骨架的改變:采用微絲熒光標(biāo)記技術(shù)同時(shí)檢測(cè)4組細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu)的變化。細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)及松弛素B處理后均出現(xiàn)微絲結(jié)構(gòu)改變,結(jié)果表明細(xì)胞骨架對(duì)微重力及松弛素都非常敏感。MC3T3-E1細(xì)胞在經(jīng)過(guò)回轉(zhuǎn)模擬微重力培養(yǎng)后,細(xì)胞微絲骨架出現(xiàn)局部

9、解聚和張力纖維減少的趨勢(shì),張力纖維短而纖細(xì),散亂分布于胞漿內(nèi)、無(wú)方向性；0.5μg/ml細(xì)胞松弛素B處理的對(duì)照組微絲解聚的程度和模擬微重力組差不多,微絲結(jié)構(gòu)也粗細(xì)不一、方向多變；模擬微重力+0.5μg/ml細(xì)胞松弛素B培養(yǎng)組的改變則更明顯,微絲明顯解聚、骨架蛋白彌散分布、細(xì)胞骨架的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失、細(xì)胞核區(qū)不可分辨；而正常重力培養(yǎng)的對(duì)照組,細(xì)胞的微絲骨架排列有序、粗細(xì)均勻、走向清晰。
　　 4.各組ALP活性:MC3T3-E1細(xì)胞在

10、正常重力組中分泌的ALP的活性最高,為6.2867±0.3980金氏單位/1000ml,和其余3組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模擬微重力+0.5μg/ml細(xì)胞松弛素B組的ALP活性為2.9333±0.7805金氏單位/100ml,較模擬微重力組稍低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而模擬微重力組和0.5μg/ml細(xì)胞松弛素B組的ALP活性分別為4.8900±0.6802金氏單位/100ml和5.6933+0.1266金氏單位

11、/100ml,兩組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5.各組OCN表達(dá)量ELISA結(jié)果:模擬微重力組MC3T3-E1細(xì)胞表達(dá)的OCN的量為2.70816±0.53271pg/ml,居于正常重力組和模擬微重力+0.5μg/ml細(xì)胞松弛素B組之間,3組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常重力組細(xì)胞OCN的表達(dá)量最高,為14.23681±2.85252pg/ml,模擬微重力+0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組最低,為

12、1.50685±0.40666 pg/ml。0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組OCN的表達(dá)量為3.84456±1.23788pg/ml,和模擬微重力組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),這和堿性磷酸酶的結(jié)果相統(tǒng)一。
　　 6.各組iNOS酶活性:模擬微重力組iNOS的酶活性為16.6043±1.3292U/ml,高于正常重力組,其值為5.8183±0.3196 U/ml,而低于模擬微重力+0.5μg/ml細(xì)胞松弛素B組,為19.6

13、990±0.5582 U/ml,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組iNOS的酶活性為15.3760±2.8211U/ml,和模擬微重力組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 7.各組eNOS酶活性:正常重力組eNOS的酶活性最高,為7.1510±0.6780 U/ml,和其余3組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模擬微重力+0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組eNOS的酶活性為1.0

14、987±0.4776 U/ml,較模擬微重力組稍低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而模擬微重力組和0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組eNOS的酶活性分別為2.3613±0.2946 U/ml和2.4633±0.4603 U/ml,兩組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 8.各組NO濃度:實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)液中均能檢測(cè)到NO的表達(dá)。模擬微重力組NO的濃度為109.2593±4.8996μ mol/L

15、,明顯高于正常重力組81.4813±2.4494μ mol/L,但低于模擬微重力+0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組129.9383±9.9865μ mol/L,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.5)。而0.5μ g/ml細(xì)胞松弛素B組NO的濃度為100.0003μ8.0721μ mol/L,和模擬微重力組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.MC3T3-E1成骨細(xì)胞株具有和原代培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞相同的生物學(xué)