CCR5拮抗劑對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是最常見的組織學(xué)類型，約占肺癌總數(shù)的80％。NSCLC起病隱匿、發(fā)展迅速，近75%的患者首診時(shí)病變已屬局部晚期或轉(zhuǎn)移性肺癌，且易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。由于現(xiàn)階段缺乏有效的治療藥物，NSCLC的復(fù)發(fā)率一直高居不下，患者往往預(yù)后不良。因此，制定新的研發(fā)策略，尋求高活性靶向藥物，成為NSCLC治療的重要途徑。
　　趨化因子受體CCR5是I型

2、人類免疫缺陷病毒（HIV-1）進(jìn)入靶細(xì)胞的輔助受體，在HIV感染過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，目前作為藥物篩選的重要靶點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于抗艾藥物的設(shè)計(jì)與研發(fā)。近年來(lái)，隨著腫瘤免疫學(xué)及分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展，CCR5在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要作用逐漸被揭示。臨床研究顯示，CCR5在NSCLC患者中異常高表達(dá)，并可預(yù)測(cè)其不良預(yù)后。另有研究表明，CCR5在NSCLC的演進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，腫瘤來(lái)源的CCR5通過(guò)與其配體相互作用，介導(dǎo)腫瘤增殖、

3、浸潤(rùn)并調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答?；谏鲜隼碚撘罁?jù)，本課題在前期選用CCR5拮抗劑Maraviroc（MVC）開展其對(duì)NSCLC的抗腫瘤活性研究。研究發(fā)現(xiàn)，MVC可有效抑制NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在高濃度下可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這一結(jié)果表明，CCR5可能是NSCLC治療的重要靶點(diǎn)。
　　基于前期的探索研究成果，本課題以CCR5作為藥物靶點(diǎn)，采用計(jì)算模擬結(jié)合生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法，篩選特異性高、抗腫瘤活性強(qiáng)的CCR5靶向阻斷藥物，并對(duì)其抗NSCLC的作

4、用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　?。?）采用逐層虛擬篩選的方法發(fā)現(xiàn)具有潛在抗腫瘤活性的CCR5拮抗劑：本研究以 CCR5為靶標(biāo)，MVC為對(duì)照分子，借助 Libdock、Surflex-Dock和CDOCKER等對(duì)接模塊對(duì)藥物信息數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，綜合考慮對(duì)接得分、理化性質(zhì)以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可行性，挑選了15個(gè)化合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬和MM/GBSA結(jié)合自由能計(jì)算。充分對(duì)比各化合物與 CCR5的相互作用以及結(jié)合親和力

5、后，最終確定nifeviroc為潛在的具有抗腫瘤活性的CCR5拮抗劑。
　?。?）探討CCR5拮抗劑對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制：采用CCK8法、Edu染色法、克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè) CCR5拮抗劑對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，與MVC相比， nifeviroc對(duì)NSCLC細(xì)胞具備更強(qiáng)地抑制作用。Nifeviroc作用A549細(xì)胞后，有效地抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖活性。其通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白

6、依賴性激酶抑制因子 p21的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4的活性，干擾細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。
　　（3）探討CCR5拮抗劑對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響：Hochest33258染色法、Annexin V-FITC/PI雙染色法、JC-1染色法及DCFH-DA探針法檢測(cè)結(jié)果顯示，與MVC相比，nifeviroc具有顯著促NSCLC細(xì)胞凋亡的作用。Nifeviroc通過(guò)促

7、進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，引起線粒體膜電位的降低，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　?。?）探討CCR5拮抗劑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制
　?、偻ㄟ^(guò) RT2 Profiler PCR array分析細(xì)胞的基因表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)nifeviroc（15μM）作用后，A549細(xì)胞中差異表達(dá)基因共84個(gè)，其中17個(gè)基因上調(diào)≥1.5倍，33個(gè)基因下調(diào)≥1.5倍。內(nèi)源性和外源性凋亡途徑中均有差異基因出現(xiàn)。
　　② Western blot

8、和Caspase活性檢測(cè)結(jié)果顯示，nifeviroc所致的凋亡過(guò)程伴有Caspase-9、Caspase-8、Caspase-7和Caspase-3的激活。Nifeviroc作用于A549細(xì)胞后，促使細(xì)胞內(nèi)Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax共同作用于線粒體，致使線粒體膜通透性增加，引起線粒體膜電位降低，線粒體功能受損。線粒體膜通透性增加促使Cyt c釋放于胞質(zhì)，與Caspase-9共同作用Caspase-3和Caspase-7，并使其

9、活化?；罨腃aspase-3、Caspase-7作用于PARP酶原，使其發(fā)生剪切，喪失修復(fù)DNA損傷的能力，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，nifeviroc還可以降低survivin蛋白的表達(dá)，進(jìn)而解除survivin對(duì)Caspase-3合成的抑制作用。
　　（5）探討CCR5拮抗劑對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響：細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，nifeviroc能顯著抑制A5

10、49細(xì)胞粘附及體外侵襲遷移能力。
　?。?）探討CCR5拮抗劑抑制A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制：細(xì)胞外基質(zhì)及與細(xì)胞粘附相關(guān)因子檢測(cè)結(jié)果顯示，nifeviroc可通過(guò)抑制A549細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1和TIMP-2的作用，使其抑制MMPs對(duì)ECM的降解，進(jìn)而減少A549細(xì)胞對(duì)基底膜的破壞，發(fā)揮抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　?。?）CCR5與拮抗劑相互作用

11、機(jī)理的分子模擬研究:在完成 nifeviroc的體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)及其作用機(jī)制的初步探討后，本研究借助分子動(dòng)力學(xué)模擬和MM/GBSA結(jié)合自由能計(jì)算等方法探討了nifeviroc、MVC與 CCR5的相互作用機(jī)理。研究結(jié)果表明：當(dāng)與 CCR5發(fā)生結(jié)合時(shí)，nifeviroc、MVC均深埋于結(jié)合口袋內(nèi)側(cè)。兩者分別同Tyr37、Trp86、Thr195、Tyr251、Thr259和 Glu283殘基形成氫鍵，加強(qiáng)與 CCR5受體的相互作用。CC

12、R5-nifeviroc與CCR5-MVC復(fù)合物體系的RMSF值顯示，兩者共享了相似的RMSF分布及動(dòng)力學(xué)特征趨勢(shì)，分別在 N-末端、C-末端及胞內(nèi)、胞外環(huán)區(qū)具有較高的 RMSF值。CCR5-MVC復(fù)合物在 N-末端和 C-末端的柔性略大于 CCR5-nifeviroc復(fù)合物，而ICL的柔性則恰好相反。在藥物結(jié)合位點(diǎn)和跨膜螺旋區(qū)域，CCR5-nifeviroc具有更低的RMSF值，表明nifeviroc與CCR5結(jié)合增加了結(jié)合口袋和跨膜

13、區(qū)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，有利于維持其與 CCR5的結(jié)合狀態(tài)。結(jié)合自由能的計(jì)算結(jié)果顯示，nifeviroc與CCR5的親和活性高于MVC，其中nifeviroc與Trp86和Glu283之間的氫鍵作用以及非極性貢獻(xiàn)是導(dǎo)致兩者親和活性差異的主要原因。
　　綜上所述，本課題通過(guò)逐層虛擬篩選方法獲得的CCR5拮抗劑nifeviroc具有較高的體外抗腫瘤活性，可以有效抑制NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，研究結(jié)果初步證實(shí)了CCR5拮抗劑用于NSCLC治療