RNAi抑制大鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞MyD88基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的：應(yīng)用RNAi(RNA interference)技術(shù)探討靶向MyD88的shRNA質(zhì)粒載體抑制大鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)MyD88基因表達(dá)的可行性。
　　 方法：采用培養(yǎng)基選擇法經(jīng)體外培養(yǎng)大鼠骨髓源DC；流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)DC表面抗原MHC-Ⅱ和OX-62表達(dá)情況；經(jīng)體外設(shè)計(jì)合成針對(duì)MyD88 mRNA序列特異性MyD88 shRNA3條，并分別構(gòu)建于Pgenesil.1質(zhì)粒，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶

2、切鑒定并測(cè)序；實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、GenePorter3000組、pHK-shRNA組、pMvD881-shRNA組、pMyD882-shRNA組和pMyD883-shRNA組等六個(gè)組別。在陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染DC；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MyD88 mRNA表達(dá)水平的變化；WesternBlot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MyD88蛋白表達(dá)水平的變化。使用SPSS17.0 for Windows進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果：經(jīng)體外

3、培養(yǎng)，每只大鼠可獲得1.0×107個(gè)DC；經(jīng)測(cè)序結(jié)果分析，pMyD881-shRNA、pMyD882-shRNA、pMyD883-shRNA均為插入正確的克隆質(zhì)粒；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示構(gòu)建的3個(gè)pMyD88-shRNA質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源DC，均能不同程度地抑制MyD88的表達(dá)，與對(duì)照組具有顯著差異(P<0.01)，其中pMyD881-shRNA質(zhì)粒組的抑制作用最為明顯，GenePorter3000組與pHK-shRNA質(zhì)

4、粒對(duì)照組間MyD88的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異(P>0.05)；WesternBlot檢測(cè)顯示3個(gè)MyD88-shRNA質(zhì)粒組中DC轉(zhuǎn)染后MyD88蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，與對(duì)照組有顯著性差異，其中pMyD881-shRNA質(zhì)粒組抑制蛋白表達(dá)作用最為明顯，空白對(duì)照組、GenePorter3000組與pHK-shRNA質(zhì)粒對(duì)照組間MyD88蛋白表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)；
　　 結(jié)論：經(jīng)體外